甘草多糖对小鼠及鼠伤寒沙门菌生长性能的影响

付道斌，廖成水*，路 霞，王晓利，辛 玲，肖宜航，宋香朋

(1.河南科技大学 动物科技学院/洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室，河南 洛阳 471023； 2.河南科技大学 医学院，河南 洛阳 471023)

抗生素在人和动物疾病治疗中发挥着极其重要的作用，但抗生素耐药和药物残留问题严重威胁着人类健康安全。微生态制剂、抗菌肽、酶制剂、中草药制剂等作为饲料添加剂在畜禽养殖业中正在逐步替代抗生素，具有广阔的应用前景。近年来，越来越多的科研工作者试图从天然动植物中筛选出活性物质开发新药物[1]，其中天然植物活性多糖具有抗炎、抗瘤、抗病毒的功效，同时可以激活、增强和调节人体免疫能力，使得天然植物活性多糖的研究成为当代医药生物技术的前沿领域之一。甘草素有“十方九草”之称，被历代名医尊称为“众药之王”，现代医学研究证明了黄酮类、三萜类和多糖类化合物是甘草的主要有效成分[2]。甘草多糖是甘草中的一类α-D-吡喃多糖，研究证明，甘草多糖可促进淋巴细胞增殖、增强吞噬细胞的吞噬功能[3-4]。随着对甘草多糖研究的不断深入，甘草多糖的部分药理作用逐渐被发现。王丽荣等[5]研究发现腹腔注射甘草多糖能明显提高小鼠的生长性能，但甘草多糖的理论研究和临床应用状况仍不容乐观。因此，将甘草多糖作为饲料添加剂应用于畜禽养殖业之前，需要加大甘草多糖的实验室基础研究和临床前期评价。本研究通过灌胃途径给予小鼠甘草多糖，观察小鼠生长性能及破鼠伤寒沙门菌感染的情况，为甘草多糖作为饲料添加剂的应用提供科学数据。

1 材料和方法

1.1 菌株、试验动物和主要试剂

鼠伤寒沙门菌SL1344株由洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室保存；6～8周龄昆明小鼠(18.0±2.0)g 138只，清洁级，购自郑州中原动物实验中心；甘草多糖购自洛阳蓝斯利科技有限公司；胰蛋白胨和酵母浸出物购自英国OXOID公司；氯化钠等其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 甘草多糖对小鼠临床状况及器官指数的影响测定

1.2.1 动物分组 将72只小鼠随机平均分为低剂量组、中剂量组、高剂量组和对照组。低剂量组：按1 mg/kg剂量给予小鼠灌胃甘草多糖，每次0.2 mL。中剂量组：按10 mg/kg剂量给予小鼠灌胃甘草多糖，每次0.2 mL。高剂量组：按100 mg/kg剂量给予小鼠灌胃甘草多糖，每次0.2 mL。对照组：正常饲养。每日灌胃给药一次，连续给药7 d。

1.2.2 临床症状观察 给予甘草多糖后每日观察小鼠的临床症状，分别于第3天、第5天和第7天用电子分析天平测定小鼠体质量。

1.2.3 免疫器官及脏器指数的测定 分别于给药后第3天、第5天和第7天处死小鼠并取出免疫器官(胸腺、脾脏)及其他脏器(肺脏、心脏、肾脏)组织，电子分析天平称量各脏器组织质量，脏器指数=小鼠脏器质量(g)/小鼠体质量(g)。再取出肺脏组织置于60 ℃电热恒温干烤箱中烘烤72 h，电子分析天平称量干质量，计算湿/干质量比值。

1.3 鼠伤寒沙门菌菌液制备

取冻干保存的鼠伤寒沙门菌SL1344划线接种于LB固体培养基，于37 ℃温箱培养过夜。第2天挑取活化好的单克隆菌接种于LB液体培养基，于37 ℃摇床振荡培养，培养至对数期后，利用无菌PBS洗涤菌液2次，备用。

1.4 甘草多糖对鼠伤寒沙门菌体外生长影响的测定

1.4.1 鼠伤寒沙门菌生长速度测定 将1.3中培养的鼠伤寒沙门菌转接LB液体培养基，分别加入终质量浓度为10、20、50、100、200 μg/mL的甘草多糖，37 ℃、200 r/min培养，每1 h取样涂板计数，至第10小时。用无菌PBS对样品进行10倍连续稀释，取100 μL稀释后的菌液均匀涂布于LB固体平板上，每组做3个重复，同时设空白对照，培养过夜后计数，取平均值计算原液的有效活菌数量，绘制鼠伤寒沙门菌的生长曲线。

1.4.2 鼠伤寒沙门菌生物被膜形成测定 采用96孔微孔板结晶紫染色法检测鼠伤寒沙门菌生物被膜形成。将1.3中培养的鼠伤寒沙门菌转接LB液体培养基，37 ℃培养过夜，按1∶20比例转接于96孔细胞培养板，分别加入终质量浓度为10、20、50、100、200 μg/mL的甘草多糖，温箱孵育48 h，同时设PBS对照孔，每孔重复3次。孵育结束后，用无菌PBS轻轻洗涤3次除去未附着的细菌，晾干后加入1%结晶紫染色45 min，用蒸馏水洗去浮色，37 ℃放置10 min干燥，每孔用200 μL乙醇溶解，于590 nm波长下检测。同时将单克隆菌液转接到含有40 mg/L刚果红和20 mg/L考马斯亮蓝的无NaCl的LB固体培养基上，37 ℃恒温倒置培养48 h，观察细菌的菌落形态。

1.5 鼠伤寒沙门菌对小鼠半数致死量(LD50)的测定

将36只小鼠平均随机分为6组(5个试验组和1个无菌PBS组)，取1.3中培养的鼠伤寒沙门菌SL1344，无菌PBS连续5倍稀释，选取合适的稀释度，每个稀释度口服感染6只小鼠，每只200 μL，观察直至无小鼠死亡，记录死亡情况，根据Bliss法计算鼠伤寒沙门菌SL1344对小鼠LD50。

1.6 甘草多糖对鼠伤寒沙门菌感染小鼠保护力的测定

将30只小鼠随机平均分为5组，按照1.2.1中方法设甘草多糖低剂量组、中剂量组、高剂量组、PBS组和空白组。于给药5 d后腹腔注射鼠伤寒沙门菌SL1344。正常饲喂小鼠，每隔12 h观察其精神状态及饮食状况，连续观察直至无小鼠死亡，记录死亡情况。

1.7 数据处理

2 结果与分析

2.1 甘草多糖对小鼠临床状况的影响

灌胃给予不同质量浓度甘草多糖后的小鼠与健康对照组相比，精神状态、采食量、饮水量、活动量等一般临床状况均无明显变化。总体上看，在第5天和第7天所有剂量组小鼠体质量均有一定增高，但差异不显著(表1)，在整个试验期间未见有其他并发症，无小鼠死亡。

表1不同质量浓度甘草多糖对小鼠体质量变化的影响

g

2.2 甘草多糖对小鼠免疫器官及其他脏器指数的影响

给予甘草多糖后小鼠免疫器官指数(胸腺和脾脏)高于正常对照组，但各时间点不同质量浓度甘草多糖对小鼠胸腺指数影响均不显著；给药后第3天脾脏指数与正常对照组相比没有显著差异，但到第5天时，各质量浓度甘草多糖可显著增加小鼠的脾脏指数，而到第7天时只有高剂量组小鼠的脾脏指数显著增加(P<0.05)(表2)。肺脏、心脏、肝脏、肾脏等小鼠的其他脏器指数在给予甘草多糖后虽然有增高趋势，但与对照组相比差异均不显著(表3和表4)。

表2 不同质量浓度甘草多糖对小鼠胸腺和脾脏指数的影响

注：与空白组相比，*表示P<0.05。

表3 不同质量浓度甘草多糖对小鼠肺脏指数与肺脏湿/干质量比值的影响

表4 不同质量浓度甘草多糖对小鼠其他脏器指数的影响

2.3 甘草多糖对鼠伤寒沙门菌体外生长的影响

甘草多糖对鼠伤寒沙门菌的影响如图1所示，10、20、50、100、200 μg/mL的甘草多糖在不同时间点与空白对照组相比均不同程度地促进鼠伤寒沙门菌的生长，但差异不显著。

图1 不同质量浓度甘草多糖对鼠伤寒沙门菌体外生长的影响

2.4 甘草多糖对鼠伤寒沙门菌生物被膜形成的影响

当添加不同质量浓度甘草多糖培养48 h后，与空白对照组相比，随着甘草多糖质量浓度增加，鼠伤寒沙门菌在聚乙烯板孔内形成生物被膜的量逐渐增加，但差异不显著(图2)。沙门菌生物被膜的主要成分为卷曲菌毛和纤维素，鼠伤寒沙门菌在刚果红和考马斯亮蓝平板上能够形成呈现红色干燥粗糙型菌落。结果发现，添加不同质量浓度甘草多糖后鼠伤寒沙门菌菌落仍呈红色粗糙型(图3)，说明甘草多糖对细菌的菌毛和纤维素的表达并无影响。

图2 不同质量浓度甘草多糖对鼠伤寒沙门菌生物被膜形成的影响

A—F：分别为0、10、20、50、100、200 μg/mL的甘草多糖处理图3 含刚果红和考马斯亮蓝的无盐LB固体平板上的菌落形态

2.5 鼠伤寒沙门菌对小鼠LD50测定结果

小鼠腹腔注射鼠伤寒沙门菌SL1344后第3天即可出现死亡，连续观察记录小鼠死亡情况，直至5 d内未出现死亡现象，根据Bliss法计算得到腹腔注射鼠伤寒沙门菌SL1344对小鼠的LD50为2.09×105cfu/mL(表5)。

表5 鼠伤寒沙门菌SL1344对小鼠的毒力测定结果

2.6 甘草多糖对鼠伤寒沙门菌感染小鼠的影响

给予小鼠不同质量浓度的甘草多糖，并在第5天腹腔感染100倍LD50的鼠伤寒沙门菌，所有感染组小鼠均出现不同程度的精神沉郁、嗜睡、呆卧不动、食欲降低等临床症状，感染后第3天出现死亡。对死亡小鼠进行解剖，肠壁变薄，肠道内充满气体，肠系膜充血、粘连；脾脏肿大、淤血；肝脏肿大，表面颜色变暗，有出血点和出血斑；肾脏充血、肿大；肺脏肿胀，呈暗红色。高剂量组小鼠感染后第9天全部死亡，低剂量和中剂量组均是第6天全部死亡，而PBS组则是在感染后第5天全部死亡(表6)，这提示甘草多糖对鼠伤寒沙门菌感染小鼠有一定的抵抗作用。

表6 甘草多糖对鼠伤寒沙门菌感染小鼠的影响

3 结论与讨论

甘草多糖作为一种多糖类化合物具有多种生物活性，包括增强体液免疫功能、促进吞噬作用、抗菌、抗补体、抗肿瘤、抗病毒以及对未感染的细胞无毒副作用等[6-7]，同时可以改善动物机体代谢、促进生长发育、提高机体免疫力等[8]。董永军等[9]研究发现甘草多糖能促进肉仔鸡体质量增加，提高其血清中新城疫抗体水平和血液中巨噬细胞吞噬功能。另外一项针对甘草多糖影响雏鸡生长性能的研究结果显示，甘草多糖对雏鸡生长性能有一定的促进作用，能够增强雏鸡的免疫力，其中质量浓度为10 g/L的甘草多糖作用效果最显著[10]。

虽然本研究结果显示，甘草多糖对小鼠生长性能无显著性影响，且对鼠伤寒沙门菌体外生长具有有限的促进作用，但可以提高小鼠抵抗鼠伤寒沙门菌感染的能力。这可能是由于甘草多糖对机体的非特异性和特异性免疫功能具有促进作用[11]。郑尧等[12]通过口服和注射不同剂量的甘草多糖研究其对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响，初步探讨了甘草多糖对试验小鼠的非特异性免疫功能方面的影响，结果显示，甘草多糖对小鼠非特异性免疫功能具有一定的促进作用。程安玮[4]研究证明甘草多糖具有促进淋巴细胞增殖的作用，并且促进作用随着剂量的增加而增加，同时还发现甘草多糖能有效刺激机体的内皮系统，活化巨噬细胞，促进B淋巴细胞的增殖，同时还可以增强自然杀伤细胞对靶细胞的杀伤作用。董永军等[13]研究发现，在饲料中添加1.0 g/kg的甘草多糖对动物消化道微生物区系的影响明显，主要由于其促进了肠道有益菌双歧杆菌和乳酸杆菌的增殖，抑制了有害菌大肠杆菌和沙门氏菌的增殖。

甘草多糖从中药甘草中提纯而出，易获取和生产，具有广泛的药理作用，且对动物机体无毒副作用[14]，拥有广阔的市场前景。本试验研究了不同剂量的甘草多糖对小鼠抵抗鼠伤寒沙门菌感染的影响，为甘草多糖的抗菌能力提供临床依据，但甘草多糖抗菌能力的具体机制尚未明确，相信随着众多科研工作者对甘草多糖研究的不断深入，甘草多糖的抗菌机制会被逐渐探索出来。