百脉根Rac1基因启动子的克隆与表达分析

柯丹霞，李祥永，彭昆鹏，韩雅彭

(信阳师范学院 a.生命科学学院; b.大别山农业生物资源保护与利用研究院，河南 信阳 464000)

0 引言

Rop(Rho GTPase of plant)是植物特有的一类小G蛋白，参与调控植物体内多种生理过程，包括花粉管的伸长、根毛的发育、防御胁迫反应、激素信号转导等[1-5].目前, 许多植物如拟南芥、水稻、杨树等的Rop基因已被克隆.近年的证据表明，Rop在共生固氮的早期信号途径中发挥重要功能[6-8]，对模式豆科植物百脉根(Lotusjaponicus)Rop基因的研究将有助于深入揭示此类基因在结瘤信号途径中的调控机制[9].启动子(Promoter)作为基因的“开关”，控制基因表达的起始和程度.克隆基因启动子并鉴定其特征序列是挖掘基因转录调控机制的关键.有关Rop家族基因启动子的克隆、序列特征分析和基因转录调控的研究报道日益增多.刘伟等[10]研究发现，蒺藜苜蓿Rop5基因在植株根系的各个部位均有表达.根瘤菌侵染后，其启动子转录活力明显升高.笔者前期在百脉根中克隆了Rop6基因的启动子，并对其表达特征进行了分析[11].石佰丽[12]对毛果杨Rop家族基因的启动子研究发现,受盐胁迫和外源激素诱导的基因，其启动子序列中也存在相应的响应元件.黄亚成[13]克隆了橡胶树的5个Rop基因启动子，软件分析发现5个启动子序列均具有多种调控元件, 部分预测的顺式作用元件通过实验手段得到了初步证实.李煜[14]发现对杨树Rop家族基因的启动子中包含大量与胁迫及激素响应相关的调控元件.

在前期工作中，克隆了百脉根的Rop家族基因Rac1，过表达Rac1的转基因百脉根结瘤数目较空白对照明显增加.推测Rac1基因可能参与调控早期结瘤信号途径[15].尽管Rac1基因的生物学功能已得到初步阐明，但有关该基因的转录调控机制尚不清楚.有关百脉根Rac1基因启动子的预测及其重要调控元件的相关研究在国内外未见报道.鉴于此，本研究在前期工作基础上，利用生物信息学方法预测Rac1基因启动子，并对其含有的顺式作用元件进行鉴定及统计分析.同时克隆Rac1基因启动子片段，并构建GUS报告基因融合的植物双元表达载体，对其功能性调控元件进行挖掘, 以揭示Rac1基因的转录调控机制.

1 材料和方法

1.1 试验材料与试剂

百脉根MG-20、发根农杆菌菌株LBA1334、植物双元表达载体p1391Z由本实验室保存；百脉根毛根转化所用基础培养基，Phytotech公司产品；DNA提取试剂盒，Takara公司产品；引物和测序由南京金斯瑞生物科技有限公司合成.

1.2 方法

1.2.1Rac1基因启动子的生物信息学分析

利用启动子在线分析软件Promoter 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)、Network Promoter Prediction(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)、Promoter SCAN(http://www- bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/)对Rac1基因的启动子进行预测.

利用http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=cpgfinder&group=programs&subgroup=promoter、http://www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/对启动子的CpG岛进行预测.

利用在线软件http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=tssp&group=programs&subgroup=promoter查找启动子含有的重要顺式作用元件.

1.2.2 基因组DNA的提取

经表面灭菌的百脉根种子置于无菌的湿润滤纸上， 22 ℃暗培养待其发芽，1周后收集幼嫩根部组织，迅速放入加有液氮的研钵内充分研磨.采用CTAB法提取基因组DNA.

1.2.3Rac1启动子的克隆及重组质粒的构建

依据Rac1基因cDNA序列(GenBank登录号：Z73961.1)，获得位于该基因翻译起始位点(ATG)上游5'-启动子区的3 kb序列.设计引物，PCR扩增ATG上游1.8 kb的目的片段.上游引物为F-Rac1-Pro(5'-AACTGCAGAGCTGCCTCTGCATCAATTTG -3')，下游引物为R-Rac1-Pro(5'-GGAATTCGTTTTGAGCTGAGTGGAAAAG -3')，以提取的基因组DNA为模板扩增.PCR扩增产物回收纯化后连接T载体测序验证.

引入PstⅠ /EcoRⅠ 位点将测序正确的目的片段插入载体p1391Z中，实现Rac1基因启动子和GUS基因的融合.引物下划线处为酶切位点序列PstⅠ和EcoRⅠ，重组质粒命名为p1391Z-Rac1Pro.

1.2.4 百脉根的毛根转化

百脉根毛根转化具体方法参照参考文献[16].种子经表面灭菌后，22 ℃暗培养获取外植体.农杆菌侵染外植体，经共培养后待毛根从下胚轴长出.剪取0.5 cm长的根尖放入GUS染液中鉴定毛根，留下显蓝的阳性毛根，切掉不显蓝的阴性毛根.

1.2.5 组织化学染色

获得的阳性转基因植株经炼苗和移栽后，接种根瘤菌MAFF303099.取接种前和接种后7 d毛根，GUS染液染色，奥林巴斯体视显微镜观察Rac1Pro:GUS在根部的表达情况.

2 结果与分析

2.1 Rac1启动子的预测

通过检索GenBank数据库，获得Rac1基因翻译起始位点(ATG)上游5'非编码区的3 kb序列.采用Promoter 2.0、Network Promoter Prediction、Promoter SCAN等3种软件预测分析，得出潜在的启动子结构(表1).

表1 Rac1启动子预测结果Tab. 1 The prediction results of Rac1 promoter

3种不同的在线软件预测的Rac1基因启动子区域存在一定的差异.启动子的预测算法有多种，不同的算法有不同的预测结果，须综合考虑.

2.2 Rac1启动子含有的顺式作用元件分析

利用生物信息学工具查找Rac1基因启动子含有的重要顺式作用元件.结果表明，该启动子含有的顺式作用元件共248个.表2列出了除未命名和无功能的调控元件外的所有可能的顺式作用元件.其中有95个与转录必需的RNA聚合酶结合的TATA-box，64个调控基因转录效率的CAAT-box.此外，在Rac1启动子中，还含有光反应、防御与胁迫反应、激素反应如乙烯、生长素、赤霉素应答元件以及与生长代谢相关的厌氧诱导、胚乳表达、分生组织表达、昼夜节律控制等调控元件(表2).

表2 Rac1启动子含有的重要顺式作用元件Tab. 2 The putative important cis-regulatory elements identified in Rac1 promoter

一般来说，真核生物基因启动子的A和T碱基含量高于C和G碱基含量.Rac1基因启动子含有的碱基A、T、C、G百分比分别为31.3%、34.4%、16.8%、17.5%，A和T碱基总和与C和G碱基总和的比值为1.92.综上，Rac1基因启动子具有真核生物启动子类似的碱基组成特征和重要调控元件.

2.3 Rac1启动子的克隆及重组质粒的构建

以提取的幼嫩根组织的基因组DNA为模板，通过PCR扩增ATG上游1.8 kb的启动子片段.PCR扩增产物大小与预期启动子片段长度(1 836 bp)一致(图1).目的片段回收纯化后连接T载体送去公司测序，确保扩增产物的序列与已发布的启动子序列完全相同.引入PstⅠ /EcoRⅠ 酶切位点将目的片段插入植物双元表达载体p1391Z中，构建Rac1基因启动子和GUS基因融合的重组质粒p1391Z-Rac1Pro.双酶切琼脂糖电泳胶图显示载体片段约为11 kb，目的片段约为1.8 kb，说明重组质粒构建成功(图2).

图1 Rac1基因启动子片段的扩增Fig. 1 The promoter fragment amplification of Rac1 gene

注：M为DL2000 DNA Marker; 1为目的片段的扩增

图2 重组质粒p1391Z-Rac1Pro的酶切鉴定Fig. 2 Digestion and identification of recombinant plasmids p1391Z-Rac1Pro

注：M为1 kb DNA ladder; 1为重组质粒p1391Z-Rac1Pro的双酶切

2.4 Rac1基因启动子的表达分析

毛根转化获得的转基因植株经GUS染色后，阳性毛根呈现蓝色，阴性毛根不变色(图3).

图3 含有p1391Z-Rac1Pro重组质粒的百脉根毛根鉴定Fig. 3 Identification of hairy roots of Lotus japonicus transformed with p1391Z-Rac1 Pro

注：A. GUS染色前的百脉根毛根; B. GUS染色后的百脉根毛根，箭头所指即为显蓝的阳性毛根

通过体视镜观察阳性毛状根中GUS的表达情况，以此分析启动子在根中的表达情况.结果显示，在未接种根瘤菌的阳性毛根中，GUS主要在根的维管束中表达，在根毛中几乎没有表达(图4 A).在接种根瘤菌7 d的阳性毛根中，GUS在根的维管束中表达量上升，在根毛中的表达尤为明显(图4 B)，在主根根尖、根瘤原基皮层中也观察到了GUS的表达(图4 C、图4D).

图4 组织化学染色检测Rac1基因的表达部位Fig. 4 Expression of Rac1 gene by histochemical staining

注：A. 未接种根瘤菌的根毛; B. 接种根瘤菌的根毛; C. 箭头所指为显蓝的毛根根尖; D. 箭头所指为显蓝的根瘤原基皮层

结果表明,Rac1基因受根瘤菌诱导表达增强，这一结论与前期Real-time PCR结果[15]相吻合.同时Rac1基因在根尖、皮层等分生区表达，也预示着Rac1基因参与调控根瘤的生长发育.

3 结论

基因启动子是控制基因表达开启的核心，克隆基因启动子序列并对其中的特征信号进行分析是了解基因转录调控表达及其调控机制的关键[17，18].百脉根Rac1基因的启动子具有类似真核生物启动子的碱基组成特征以及重要的顺式作用元件，如转录调控核心元件TATA-box和CAAT-box，表明上述元件在调控下游基因的转录中发挥着重要作用.此外，在Rac1基因启动子中，还发现多种与光照、防御与胁迫、激素以及生长代谢等非生物环境信号应答相关的调控元件，表明Rac1的表达可能还与上述内在信号和环境因子的状况密切相关.组织化学染色法发现Gus基因在接种根瘤菌的毛根维管束和根毛中表达量明显上升，说明Rac1基因受根瘤菌诱导表达增强，在根尖、皮层等分生区检测到Gus的表达，表明Rac1基因可能参与调控根瘤的生长发育.

本研究为阐明百脉根小G蛋白Rac1基因的转录调控机制奠定了基础.下一步将构建Rac1基因启动子不同长度片段驱动报告基因Gus表达的系列双元表达载体，通过遗传转化百脉根获得阳性毛根，进而通过不同启动子长度片段表达特征的分析，由此鉴定Rac1基因启动子中含有的重要调控元件及其进一步精细定位.