RP—HPLC法同时测定酶法合成阿莫西林工艺中的原料、中间体和产物的含量

李胜男

摘 要：本文采用高校液相测定了阿莫西林工艺中的原料、中间体和产物中6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林的含量，固定相为：瑞士Hamilton反相液相色谱柱 HxSil C18液相色谱柱（150*4.6mm，5un），乙腈-0.2M磷酸二氢钠-0.2M磷酸氢二钠（10：85：5）为流动相，检测波长为230nm；此方法简便、准确、重现性好，可用于阿莫西林工艺中的原料、中间体和产物中6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林的含量测定。

关键词：阿莫西林；原料；含量

酶法合成技术始于20世纪60年代末70年代初，现在酶缩合反应技术、产品分离以及固定化酶技术等方面取得很大的发展，配套技术日益完善。酶法产品主要有产品含量稳定并且杂质低；酶法产品生产批量能够达到化学法产品的2～3倍；有机溶剂的使用量大幅度减少90%，废水排放减少80%等特点。本文采用高效液相法对阿莫西林工艺中的原料、中间体和产物中的6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林的进行了含量测定。

1 仪器与试药

LC-2212型液相色谱仪（北京中科惠分仪器有限公司）；兰博OV3000大容量柱温箱（天津市兰博实验仪器设备有限公司）；和泰Master-S超纯水机（自来水为水源）（上海和泰仪器有限公司）；BILON-1000C多用途恒温超声提取机（上海比朗仪器制造有限公司）；600220液相保护柱（天津琛航科苑科技发展有限公司）。乙腈（重庆跃翔化工有限公司）、磷酸二氢钾（重庆跃翔化工有限公司）、三乙胺（重庆跃翔化工有限公司）、磷酸（天津市精强化工有限公司）醋酸乙酯（重庆跃翔化工有限公司）、甲酸（天津市精强化工有限公司）、乙醇（重庆跃翔化工有限公司）、乙酸铵（重庆跃翔化工有限公司）。6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林对照品自制。

2 含量测定

2.1 色谱条件：依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下[1-5]。色谱柱为瑞士Hamilton 反相液相色谱柱 HxSil C18液相色谱柱（150*4.6mm，5un）；乙腈-0.2M磷酸二氢钠-0.2M磷酸氢二钠（10：85：5）为流动相；检测波长为230nm；流速1.0mL·min-1；柱温：30℃。理论板数按阿莫西林峰计算应不得低于2500。

2.2 供试品溶液的制备

取阿莫西林工艺中的原料、中间体和产物适量，精密称取，置50mL棕色量瓶中，加流动相适量，超声处理提取5分钟，放置至室温，加流动相稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，即得。

2.3 对照品溶液的制备

取105℃干燥5小时的6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林对照品适量，精密称取6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林对照品约10mg，置50mL棕色容量瓶中，用加流动相超声溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每1mL溶液中含6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林0.2mg）。

2.5 标准曲线的制备

制备浓度为50、100、150、200、250、300、350、400μg·mL-1的6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林对照品溶液，分别精密吸取10μL注入HPLC，记录色谱图。以峰面积积分值A（μg）为横坐标，进样量为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。试验表明，6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林对照品在50～400μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.6 精密度试验

依照制备对照品溶液，精密吸取6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林对照品溶液10μL重复进样6次，测定峰面积积分值，对照品峰面积积分值的RSD为0.86%，0.85%，0.86%，0.93%。结果表明，本实验精密度良好。

2.7 重现性试验

分别称取同批样品6份，分别依照2.2项下供试品制备方法制备供试品，按质量标准含量测定项下方法测定含量，并计算样品的RSD值为0.75%，0.81%，0.79%，0.85%，结果表明，此含量测定方法的重现性良好。

2.8 稳定性试验

依照供试品制备方法制备供试品溶液，分别在0，30，60分钟精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，进样测定，供试品6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林峰面积积分值的RSD为0.77%，0.76%，0.81%，0.85%。结果表明6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林至少在60分钟内稳定。

2.9 回收率试验

采用加样回收试验，取已知含量的同一批供试品各6份，精密称定，分精密添加一定量的6-氨基青霉烷酸、D-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸、阿莫西林对照品，按供试品制备所述方法制备供试品溶液，测定含量（同时测定样品含量），计算回收率。6次测定的平均回收率为99.5%，99.3%，99.5%，99.3%，RSD为0.86%，0.79%，0.81%，0.78%。

3 讨论

分别考察乙腈-0.2M磷酸二氢钠-0.2M磷酸氢二钠（10：85：5），乙腈-30mmol·L-1碳酸氢铵水溶液（含有0.7%氨水、0.1%三乙胺）线性梯度洗脱，乙腈-水（46∶54），乙腈-水-三乙胺（30：70：0.1）；0.2%三乙胺溶液（用磷酸調p H至5.3）-乙腈（65∶35）；甲醇-乙腈-甲酸-水（30：10：1：59）；不同比例的流动相，结果以乙腈-0.2M磷酸二氢钠-0.2M磷酸氢二钠（10：85：5）为流动相，供试品各峰分离效果最好，故选用乙腈-0.2M磷酸二氢钠-0.2M磷酸氢二钠（10：85：5）为流动相。

参考文献

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