泛素特异肽酶3作为膀胱癌新型预后标记物的研究

尤洪科 尹永华 文博

1广州医科大学附属深圳沙井医院泌尿外科 518104 广东深圳

膀胱癌(bladder cancer)在我国发病率远高于前列腺癌和肾癌，位于泌尿生殖系统肿瘤第一位[1]。针对膀胱癌的分子预后研究可以进一步制定肿瘤的个体化治疗和随访监测方案。然而，由于既往肿瘤分子预后研究需要大样本量的肿瘤标本进行检测，工作量大、时间长而且研究成本非常高，因此，目前临床上能用于判断膀胱癌预后的生物标记物比较少。生物信息学是近年来非常热门的研究工具，结合庞大且可信度高的基因检测和肿瘤信息数据库，为探索膀胱癌预后分子标记提供了极大的方便[2, 3]。

泛素特异肽酶3(ubiquitin specific peptidase 3, USP3)最早于1999年被发现，基因定位于人类染色体15q22.3，分子量为59 kd，它也是目前已知的第二个能够裂解泛素-脯氨酸结合的泛素特异蛋白酶，维持基因组的稳定性[4, 5]。研究表明，USP3可以通过去泛素化调节目的蛋白的表达水平，与肿瘤的发生发展密切相关[6, 7]。然而，到目前为止关于USP3在膀胱癌中的表达和作用尚未见相关研究报道。本课题首先运用Oncomine数据库比较USP3基因在正常膀胱组织和膀胱癌中的差异性表达，并利用免疫印迹试验、定量PCR和免疫组化进行验证，结合美国癌症基因组图谱(TCGA)数据，分析USP3预测膀胱癌预后的作用以及作用机制，为后续研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人膀胱癌细胞系T24和J82以及人正常尿路上皮细胞SV-HUC-1购自中国科学院上海典型培养物保藏中心。胎牛血清、Opti-DMEM高糖无血清培养基购自美国Gibco公司；F12K培养基购自美国Sigma公司。10例人膀胱癌及对应癌旁组织均选自宝安区第二人民医院集团总院泌尿外科2015～2017年手术切除样本，标本均经我院两位病理专家进行病理证实，采集前经过医院伦理委员会批准和患者知情同意。Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；逆转录试剂盒(日本Takara公司)；荧光定量PCR试剂盒(美国Roche公司)；免疫组化试剂盒(丹麦DAKO公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；一抗兔抗USP3(美国Abcam公司)；一抗兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、辣根过氧化物酶标记的二抗羊抗兔IgG(美国CST公司)；超敏ECL发光试剂盒(美国Millipore公司)。

1.2 实验方法

细胞培养：人膀胱癌细胞系T24和J82细胞用含10%的胎牛血清的Opti-DMEM培养基培养，而人正常尿路上皮细胞SV-HUC-1用含10%胎牛血清的F12K培养基培养。所有细胞均在37.5%CO2孵育箱中培养。

实验荧光定量PCR：按Trizol说明书抽提细胞总RNA，对所得的RNA进行浓度、纯度和完整性的检测。然后按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应，反应条件为：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃ 1 s。实时荧光定量PCR反应条件为：预变性95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 20 s，共进行40个循环，GAPDH作内参。采用2-△△CT法进行计算。USP3引物正义链序列5' CAAGCTGGGACTGGTACAGAA3'，反义链序列5' GCAGTGGTGCTTCCATTTACTT 3'；GAPDH引物正义链序列5' AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC3'；反义链序列5' TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3'。

免疫蛋白印迹试验(Western Blot)：向细胞加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上裂解30 min。4℃，12 000 g离心30 min，将上清移至新的EP管。然后对所得的蛋白液进行BCA法测浓度。配制8%的分离胶和5%的浓缩胶，按30 g每孔的上样量恒压电泳。然后将蛋白电转至NC膜后，用5%的脱脂奶粉封闭。将目的条带孵育在USP3(1∶1 000，Abcam)和GAPDH(1∶1000，CST)一抗中4℃过夜。第2天再孵育二抗1 h，然后用超敏ECL发光液进行曝光。曝光仪器采用Syngene Box自动曝光仪(Cambridge, UK)。

免疫组织化学试验：免疫组化采用SP法，DAB染色。严格按照DAKO免疫组化试剂盒来检测。常规脱蜡，水化，3%H2O2灭活内源性过氧化物酶，枸橼酸盐缓冲液行微波抗原修复。山羊血清封闭，滴加USP3多克隆抗体(1∶100)4℃过夜，滴加生物素标记二抗孵育30 min，DAB显色，苏木素复染，透明，中性树胶封片。

生物信息学分析：①USP3基因表达预测：采用Oncomine在线数据库(www.oncomine.org)比较USP3基因在正常膀胱组织和膀胱癌组织中的表达差异；②USP3基因与生存分析：采用TCGA数据库研究USP3基因表达高低与膀胱癌生存时间和复发率的关系(https://cancergenome.nih.gov/)；③USP3作用网络预测：利用STRING数据库预测USP3相互作用蛋白(https://string-db.org/)；④KEGG Pathway分析：采用生物学通路数据库(www.genome.jp)在线预测USP3及相关作用蛋白的KEGG Pathway；⑤GO富集分析：利用GO数据库找到富集USP3及相关作用蛋白的GO分类条目，寻找它们可能的功能(http://www.geneontology.org/)。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 生物信息学预测USP3基因在膀胱癌和正常膀胱组织中的表达

利用Oncomine数据库检索比较膀胱癌和正常膀胱组织中USP3基因表达的数据，发现共有三组研究符合标准(图1)。从图1可见，三组研究的结果都显示浅表性膀胱癌和浸润性膀胱癌组织中USP3的mRNA水平均明显高于正常膀胱组织中的表达(P<0.05)。

2.2 验证USP3在膀胱癌组织和癌旁组织中表达

为了进一步验证USP3在膀胱癌中的表达，我们选取了10例膀胱癌及对应的癌旁组织进行验证。从PCR检测可以观察到膀胱癌中USP3的mRNA水平要明显高于对应的癌旁组织，两者之间的差异有统计学意义(P<0.05)(图2A)。另外，免疫组化结果也可看出膀胱癌组织中USP3的蛋白含量也高于癌旁正常组织(图2B)。

2.3 比较USP3在膀胱癌细胞株和正常尿路上皮细胞株中的表达

我们同样利用Western Blot和荧光定量PCR在细胞水平上比较USP3在膀胱癌细胞株和正常尿路上皮细胞株中蛋白和mRNA的表达水平。Western Blot结果可以观察到膀胱癌细胞株T24和J82中USP3蛋白含量明显高于对照组的正常尿路上皮细胞株SV-HUC-1(图2C)。而PCR结果也验证了膀胱癌细胞株T24和J82中USP3的mRNA水平明显高于对照组的正常尿路上皮细胞株SV-HUC-1，均差异有统计学意义(P<0.05)(图2D)。以上结果说明USP3在膀胱癌中高表达，很可能一个癌基因。

2.4 利用TCGA数据库分析USP3基因表达高低与膀胱癌总生存期和复发率的关系

USP3表达高低对膀胱癌总生存期和复发的预测的结果见图3。生存曲线显示USP3高表达组的预后明显低于USP3低表达组，组间差异有统计学意义(P<0.05)(图3A)，提示USP3可以作为膀胱癌的一个预后标记物。另外，虽然USP3高表达组与低表达组之间的复发率没有统计学意义，但结果显示USP3高表达组膀胱癌的复发率高于低表达组(图3B)。

图1 USP3基因表达数据

图2 USP3在膀胱癌细胞株和正常尿路上皮细胞株中的表达

图3 USP3表达对膀胱癌总生存期和复发的预测结果

2.5 USP3作用机制预测

为探讨USP3可能的作用机制，我们利用STRING蛋白相互作用数据库进行分析，结果显示极可能与USP3发生相互作用的蛋白有10个(图4)。对上述10个蛋白进行GO富集分析，提示USP3相互作用蛋白的主要功能包括组蛋白去泛素化、染色体构建、组蛋白修饰(相对于背景P<0.001)，见表1。另外对USP3相互作用蛋白进行KEGG Pathway分析，结果显示与USP3相互作用的蛋白涉及系统性红斑狼疮、酗酒、病毒性致癌、基底转录因子(P<0.05，相对于背景差异有统计学意义)，见表2。

图4 与USP3发生相互作用的蛋白

GO ID类别数目检错率GO:0016578组蛋白去泛素化43.72e-06GO:0006325染色质构成73.58e-05GO:0051276染色体构成70.000198GO:0016570组蛋白修饰50.000643GO:0031647蛋白稳定性调节40.00268GO:0043966组蛋白H3 乙酰化30.00322GO:0070647通过小蛋白连接或去除进行蛋白修饰50.0192

表2 USP3预测交集基因的KEGG Pathway分析

3 讨论

膀胱癌作为我国最常见的泌尿系统肿瘤，严重影响人民的生命健康。随着目前对膀胱癌诊断技术的发展(包括影像学、分子诊断学等)，越来越多的膀胱癌能在早期被诊断出来，并且接受手术治疗。但是膀胱癌具有复发率高的特点，对于膀胱癌患者术后是否需要进一步干预以及如何制定个体化随访方案可能影响患者最终的预后。因此，寻找有效的膀胱癌预后标记物尤为重要。但是，由于膀胱癌预后标记物的探索成本高和随访验证时间长，所以相对于数量充足的膀胱诊断标志物(如膀胱肿瘤抗原、核基质蛋白22、端粒酶等)，目前有效的膀胱癌预后标记物非常少。然而，随着生物信息学的发展以及全球癌症基因组数据库的共享，利用大样本的生物信息学预测结合验证使寻找膀胱癌预后标记物成为可能。

泛素-蛋白酶体途径是一个具有多种功能的蛋白翻译后修饰的途径，可以通过调节泛素化和去泛素化控制蛋白的表达水平及信号通路的活化，参与人体内多种细胞生命活动[8]。而这个途径包含了泛素化和去泛素化。泛素化涉及的酶包括泛素激活酶、泛素结合酶和泛素蛋白连结酶；而发挥去泛素化作用的酶则包括泛素特异肽酶、去泛素化酶和泛素C端降解酶[9]。泛素特异肽酶既可以裂解泛素与多肽的结合，又可以裂解转录后蛋白与泛素的连接[4]。到目前为此，已知的泛素特异肽酶家族成员有22个，而泛素特异肽酶3(USP3)属于其中一员。虽然USP3在1999年被发现，但是目前相关的研究比较少。研究发现USP3是组蛋白H2A的去泛素化酶，调节DNA双链断裂时泛素依赖的DNA修复[5, 10]。现在大部分的研究集中于USP3对泛素化作用的过程，探讨USP3与肿瘤的关系的文章非常少。而已有大量研究表明泛素特异肽酶家族的其他成员(如USP9、USP22)与肿瘤发生发展密切相关[11, 12]。另外，有文献报道USP3的表达与结直肠癌的转移密切相关[6]。而我们的研究是首次通过生物信息学发现USP3与膀胱癌密切联系，并分析了其作为预后标记物的可能性及机制。

本课题利用Oncomine数据库中大样本量的数据进行综合分析，结合我们的验证结果，膀胱癌中的USP3的表达水平明显高于正常膀胱组织，无论是在细胞中还是组织中，提示USP3可能是一种膀胱癌的肿瘤相关蛋白。然后利用TCGA数据库预测USP3的表达与生存期及复发率的关联性，发现USP3表达越高，患者生存期越短，呈负相关趋势，提示USP3可能具有评估膀胱癌患者生存预后的作用。而USP3作为一个膀胱肿瘤相关蛋白，如何参与膀胱癌的发生发展还需进一步实验探讨，而我们的研究结果为USP3作用网络的生物信息学预测提供了一定的研究思路。