超高效液相色谱—串联质谱法快速测定动物源食品中万古霉素残留量

周迎春 刘少博 韩海涛 彭新然

摘 要：提供一种利用超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法快速测定动物源性食品中万古霉素残留量的方法。冻猪背膘、冻猪去骨前腿皮和冻猪去骨前腿肉样品用0.1%甲酸水溶液-乙腈溶液（90∶10，V/V）提取，所得提取液用水饱和正己烷除脂、MCX固相萃取柱净化，净化液经氮吹浓缩、流动相定容后用UPLC-MS/MS仪测定。结果表明：在2.0～100.0 μg/L质量浓度范围内，万古霉素的线性关系良好，R2>0.999 9；该方法的最低检出限为0.3 μg/kg，定量限为1.0 μg/kg；在10.0、20.0、50.0、100.0 μg/kg 4 个添加水平下，3 种样品中万古霉素的回收率为70.05%～102.97%，相对标准偏差≤4.65%。该方法有效解决了样品基质效应大、灵敏度低等问题，能够保证分析结果的准确性，适用于动物源性食品，尤其是高脂肪含量的动物源性食品中万古霉素的残留量测定。

关键词：万古霉素；超高效液相色谱-串联质谱；动物源性食品；正己烷脱脂；固相萃取

Abstract： A rapid method for the determination of vancomycin residues in animal-origin foods by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS-MS） was presented. The sample was extracted with 0.1% formic acid-acetonitrile （90：10， V/V）. The extract was degreased with n-hexane and cleaned up by solid phase extraction on an MCX column， concentrated by nitrogen blowing and diluted again with the mobile phase prior to being analyzed by UPLC-MS-MS. The calibration curve of vancomycin had a good linearity with a correlation coefficient higher than 0.999 9 in the concentration range of 2.0 to 100.0 μg/L. The detection limit of this method was 0.3 μg/kg， and the limit of quantification was 1.0 μg/kg. The recoveries of vancomycin in spiked samples ranged from 70.05% to 102.97% at spiked levels of 10.0， 20.0， 50.0 and 100.0 μg/kg， with relative standard deviations ≤ 4.65%. This method overcame the problems of high matrix effect and low sensitivity， thereby ensuring the accuracy and reproducibility of the results. This method was suitable for determination of vancomycin residues in animal-origin foods， especially high-fat animal-origin foods.

Keywords： vancomycin； ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry； animal-origin foods； hexane degreasing； solid phase extraction

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201804010

中圖分类号：O657.63 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2018）04-0056-06

引文格式：

周迎春， 刘少博， 韩海涛， 等. 超高效液相色谱-串联质谱法快速测定动物源食品中万古霉素残留量[J]. 肉类研究， 2018， 32（4）： 56-61. 万古霉素（分子式C66H75Cl2N9O24）属于糖肽类抗生素，分子结构中含有1 个二氯三苯基醚结构单元、2 个糖基、多个氨基酸以及碱性的伯氨基团，呈弱碱性，易溶于水，难溶于有机试剂[1]。万古霉素具有能引起耳、肾毒性[2-5]、皮肤过敏反应[6]、神经系统毒性和器官功能紊乱[7]等副作用[8]，我国农业部第560号公告[9]规定万古霉素为禁用兽药。但由于万古霉素具有良好的抗菌作用[10-12]，可以抑制细菌的生长和繁殖，对各种革兰氏阳性球菌与杆菌均具有强抗菌作用[13]，在经济利益的驱动下，仍有不法分子将其用于动物疾病治疗，甚至将其作为饲料添加剂用于预防非治疗性疾病和促进牲畜生长等[14]。

目前，万古霉素的主要检测方法有高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法[15]、二维液相色谱（liquid chromatography，LC）法[16-17]、液相色谱-串联质谱（LC-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法[18-19]、酶放大免疫分析法[20-22]、酶联免疫法[23-24]、化学发光免疫法[25]、荧光偏振免疫法[26]、毛细管电泳化学发光法[27]、近红外光谱法[28]及微生物法[29-30]等。相关研究多集中在医药卫生领域，检测对象多为人体或动物血液、脑脊液、饲料等样品，而动物源性食品中万古霉素的检测方法也主要针对鱼[31]、虾[32]、乳[33]及乳制品[34]，对于脂肪含量较高、基质成分复杂的动物源性食品中万古霉素的测定研究还非常少，且提供的方法相对复杂、灵敏度低[35]。相比于其他方法，超高效液相色谱-串联质谱（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法具有很好的定性能力，可以较好地排除基质干扰，具有较高的灵敏度。本研究利用UPLC-MS/MS法提供了一种更适合测定高脂肪含量动物源性食品中万古霉素含量的方法，旨在解决动物源性食品基质复杂、易受其他杂质干扰及不易实现准确定性定量等问题[36]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

进口冻猪背膘（34 份）、冻猪去骨前腿皮（18 份）、冻猪去骨前腿肉（25 份）由河南进口肉类指定口岸漯河查验区提供。

万古霉素标准品（纯度94.1%） 德国Dr.Ehrenstorfer公司；甲酸（质谱纯）、乙腈、甲醇（均为色谱纯） 美国Fisher Scientific公司；实验用水为Millipore系统制得的高纯水；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

6470超高效液相色谱-串联质谱仪、5982-9110固相萃取装置 美国Agilent公司；MCX、SCX、PCX、HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL，粒径30 μm） 美国Waters公司；VX-Ⅲ涡旋振荡器 北京踏锦科技有限公司；5810R离心机 德国Eppendorf公司；N-EVAP氮吹仪 美国Organomation公司；KQ 5200DE数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；XPE 205分析天平（感量0.01 mg） 瑞士Mettler-Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

標准储备溶液配制：精密称取（10.63±0.01） mg万古霉素标准品，用纯水溶解并定容至100 mL，配制成质量浓度为100.0 μg/mL的标准储备溶液，4 ℃条件下可保存1 个月。

标准中间溶液配制：准确吸取上述万古霉素标准储备溶液1.0 mL于100 mL棕色容量瓶中，用水稀释成质量浓度为1.0 μg/mL的标准中间溶液，将此溶液转移至储液瓶中，4 ℃条件下可保存1 个月。

标准工作溶液配制：使用前根据需要将万古霉素标准中间溶液用0.1%甲酸水溶液-乙腈溶液（90∶10，V/V）稀释成适当浓度的标准工作溶液。

1.3.2 样品前处理

1.3.2.1 提取

称取制备好的样品（2.00±0.01） g，加入20.0 mL 0.1%甲酸水溶液-乙腈溶液（90∶10，V/V），涡旋振荡混匀，超声提取20 min，然后在5 000 r/min条件下离心5 min，将全部上清液转移至另一洁净离心管中。

1.3.2.2 除脂

在1.3.2.1节得到的上清液中加入20.0 mL水饱和正己烷，涡旋振荡混匀后，在5 000 r/min条件下离心5 min，取下清液，待净化。

1.3.2.3 萃取净化

依次用5.0 mL甲醇和5.0 mL 0.2 mol/mL盐酸溶液活化MCX固相萃取柱后，取10.0 mL待净化液上样，控制流速为1～2 mL/min，弃去流出液；用5.0 mL甲醇淋洗除杂，弃去流出液；最后用5.0 mL 4%氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，40 ℃氮气吹干，用0.1%甲酸水溶液-乙腈溶液（90∶10，V/V）定容至1 mL，过0.22 μm微孔滤膜，上机测定。

1.3.3 UPLC条件

色谱柱：Poroshell 120 EC-C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm），流动相梯度洗脱程序如表1所示，柱温35 ℃，进样量10.0 μL。

1.3.4 MS条件

电喷雾离子源；正离子模式；多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式；干燥气温度300 ℃，干燥气流速6 L/min；毛细管电压4 000 V；其他参数如表2所示。

1.3.5 标准曲线的绘制

将万古霉素标准中间溶液用0.1%甲酸水溶液-乙腈溶液（90∶10，V/V）稀释成质量浓度分别为2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的系列标准工作溶液，上机测定。以色谱峰面积为纵坐标（y），相应的万古霉素的质量浓度为横坐标（x），得到万古霉素的标准曲线和相关系数。

1.3.6 方法验证

在阴性冻猪背膘、阴性冻猪去骨前腿皮和阴性冻猪去骨前腿肉样品中添加适量万古霉素标准工作液，制得万古霉素的添加量分别为10.0、20.0、50.0、100.0 μg/kg的样品，每个添加水平6 个平行样品，计算回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），考察方法的准确度和精密度。

在空白样品中添加系列质量浓度的标准工作溶液，以最低检出浓度计算检出限，在能够定性分析的基础上，以定量离子的信噪比不小于10为定量限，考察方法的灵敏度。

2 结果与分析

2.1 实验条件的优化

2.1.1 提取溶剂的选择

根据万古霉素易溶于水、微溶于甲醇等有机溶剂这一性质[37]，提取溶剂以水为主要成分；考虑到动物源性食品中一般脂肪含量较高，为使样品充分接触提取溶剂，确保万古霉素的充分提取，可在提取溶剂中加入适量既易溶于水又易溶于脂肪的极性溶剂。符合条件的常用有机溶剂有乙腈、乙醇和甲醇，但考虑到提取液脱脂时需要用到正己烷萃取技术，而乙醇又与正己烷混溶，不能达到较好的除脂效果，因此，本研究对比了10%乙腈水溶液和10%甲醇水溶液对进口冻猪背膘中万古霉素的提取效率。结果表明，二者均能有效提取进口冻猪背膘中的万古霉素。使用10%甲醇水溶液作为提取溶剂时，提取液相对比较浑浊，且提取液经脱脂和固相萃取净化后，目标物附近仍有较大的杂质峰，而使用10%乙腈水溶液作为提取溶剂时则没有观察到明显的干扰峰，这可能是由于与甲醇相比，乙腈的极性相对较强，不容易溶解太多进口冻猪背膘中的非极性杂质，从而减少了干扰峰的出现。

本研究进一步对比了纯水、5%乙腈水溶液、10%乙腈水溶液和20%乙腈水溶液对进口冻猪背膘中万古霉素的提取效率，结果表明，10%乙腈水溶液作为提取试剂时的提取效率最高。最后，本研究对比了10%乙腈水溶液、0.05%甲酸水溶液-乙腈溶液（90∶10，V/V）、0.1%甲酸水溶液-乙腈溶液（90∶10，V/V）和0.2%甲酸水溶液-乙腈溶液（90∶10，V/V）对进口冻猪背膘中万古霉素的提取效率，结果表明，0.1%甲酸水溶液-乙腈溶液（90∶10，V/V）作为提取试剂时，进口冻猪背膘中万古霉素的提取效果最好。

综上所述，本研究选取0.1%甲酸水溶液-乙腈溶液（90∶10，V/V）作为动物源性食品中万古霉素测定时的提取溶剂，此条件下得到的提取液经脱脂和固相萃取净化后，目标物附近无明显的干扰峰，峰型好，回收率高。

2.1.2 脱脂技术的选择

动物源性食品中不可避免会存在脂肪，特别是冻猪背膘、猪腩等动物源性食品，其脂肪含量可达50%以上，大量脂肪的存在会严重影响固相萃取柱的柱效，因此，在固相萃取净化之前，有必要对提取液进行脱脂处理。正己烷具有很好的脱脂及去除其他干扰杂质的效果，由于正己烷与水有少量互溶，提取溶剂中又含有大量水，且万古霉素易溶于水，为避免萃取时造成万古霉素的损失，宜采用水饱和正己烷去脂。本研究对比了冷冻脱脂和水饱和正己烷脱脂技术的脱脂效果，结果表明，使用水饱和正己烷脱脂更彻底，脱脂后的提取液更加澄清，固相萃取净化时不易造成柱堵塞。

2.1.3 固相萃取小柱的选择

由于万古霉素是一种偏碱性的三环糖肽类抗生素[38]，因此宜选择阳离子交换型固相萃取小柱對脱脂后提取液进行净化，以除去中性和酸性干扰物，吸附和保留目标物。本研究分别选取MCX、SCX、PCX、HLB柱进行固相萃取，通过对比色谱峰及回收率得出，MCX柱的保留效果和净化效果最好。

2.1.4 UPLC流动相与色谱柱的选择

在流动相中加入适量甲酸，可以在万古霉素离子化过程中提供质子，增加其响应强度，因此本研究选取0.1%甲酸水溶液和乙腈作为流动相。

分别对比Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）与Eclipse Plus C8 RRHD（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）液相色谱柱对万古霉素的分离效果，结果表明，使用C18液相色谱柱时，万古霉素峰型更好，可以形成尖的对称峰，且响应值更高，故选择C18液相色谱柱对万古霉素进行定量分析。在此条件下，100 μg/L万古霉素标准溶液的总离子流图及提取离子色谱图如图1所示。

2.1.5 主要MS参数的确定

万古霉素分子结构中存在多个伯胺基和叔胺基，这使其在离子化过程中容易得到质子，在正电离时具有较高的信号强度，因此，本研究选择电喷雾离子源，正离子模式。通过全扫描可知，万古霉素在正电离时形成[M+2H]2+的准分子离子峰[39]，母离子的质荷比（m/z）为725.4；通过子离子扫描可知，万古霉素的定量离子m/z为144.2，定性离子m/z分别为1 307.0和100.0。在全扫描和子离子扫描的同时优化各项MS参数，在优化好的MS参数条件下，采用MRM模式对样品进行定量测定。在优化好的条件下，100 μg/L万古霉素标准溶液的质谱图如图2所示。

2.2 标准曲线方程及相关系数

在本研究方法的条件下，万古霉素在2 min内快速出峰。在2.0～100.0 μg/L质量浓度范围内，万古霉素的线性方程为y=301.899 3x-1.398 5，R2≥0.999 9，线性关系良好。

2.3 方法的回收率、精密度和灵敏度

由表3可知：在10.0、20.0、50.0、100.0 μg/kg 4 个添加水平时，冻猪背膘中万古霉素的回收率在70.05%～76.65%之间，RSD为1.41%～4.65%；冻猪去骨前腿皮中万古霉素的回收率在90.65%～102.97%之间，RSD为1.99%～3.74%；冻猪去骨前腿肉中万古霉素的回收率在79.14%～100.50%之间，RSD为2.74%～4.19%。阴性冻猪背膘样品的色谱图和万古霉素添加量为50.0 μg/kg的阴性冻猪背膘样品的总离子流图及提取离子色谱图如图3～4所示。

以最低检出浓度计算，冻猪背膘冻、猪去骨前腿皮和冻猪去骨前腿肉中万古霉素的检出限分别为0.5、0.3、0.3 μg/kg，定量限分别为1.5、1.0、1.0 μg/kg。

本研究的检出限与定量限与梁玉禧等[40]的研究结果相同，但本研究所提供方法的称样质量仅为2.00 g，而梁玉禧等[40]的研究中称样质量为10.00 g；另外，本研究所提供的方法精密度更高、回收率更好。王玉琴等[8]提供的方法的检出限与定量限略高于本研究，但本研究的称样质量更少，精密度和回收率也远远高于前者。此外，本研究所提供的方法在用于检测脂肪含量较高、基质更复杂的冻猪背膘等样品时依然具有很好的准确度和精密度，符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》[41]对于新方法确证的标准要求。

2.4 实际样品测定

为进一步确认本研究方法的可行性和可靠性，将其用于测定由河南进口肉类指定口岸漯河查验场提供的共计77 份样品，其中包括34 份进口冻猪背膘、18 份进口冻猪去骨前腿皮及25 份进口冻猪去骨前腿肉。所有样品均未检出万古霉素，表明本研究方法适合用于动物源性食品中万古霉素残留量的检测。

3 结 论

本研究采用固相萃取技术和UPLC-MS/MS相结合的分析方法，解决了动物源性食品，特别是脂肪含量较高的动物源性食品基质干扰严重、灵敏度低等难题，且方法操作简单、方便、成本低、准确度高、检出限低、稳定性好，能够有效保证分析结果的重复性，适用于批量检测动物源性食品中万古霉素的残留量，可以较好地满足实际工作的需要。

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