基于TaqMan实时荧光PCR检测鲜肉及加工肉制品中的驴源性成分

海小 刘国强 罗建兴 郭梁

摘 要：根据出入境检验检疫行业标准SN/T 3730.4—2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第4部分：驴成分检测 实时荧光PCR法》合成引物和探针，利用TaqMan实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术检测鲜肉及加工肉制品中的驴源性成分。首先对13 种不同动物鲜肉组织的DNA进行驴源性成分特异性检测，然后对驴源性DNA模板原液进行梯度稀释，检测方法灵敏度，最后在加工肉制品中检测方法的适用性。结果表明：本研究建立的方法特异性强，除驴肉外，牛、羊、猪、马、骆驼、鹿、狗、兔、鸡、鸭、鸽子、鹌鹑12 种动物鲜肉组织均无特异性扩增；方法的灵敏度较高，驴组分DNA的检出限可达100 fg/μL，灵敏度可达0.01%；方法的适用性较广，可以用于加工肉制品中驴源性成分的检测。

关键词：TaqMan实时荧光PCR技术；鲜肉及加工肉制品；驴源性成分；特异性；灵敏度

Abstract： In this study， we synthesized a set of primers and TaqMan probe according to the industry standard （SN/T 3730.4—2013） for the detection of donkey-derived ingredients in raw and processed meats by real-time fluorescence polymerase chain reaction （PCR）. The specificity of the primers and probe were tested using DNA templates extracted from raw meats from donkey and 12 other animal species. Gradient dilutions of the donkey-derived DNA template were used to evaluate the sensitivity. The applicability of the PCR assay for processed meat was also investigated. The results showed that this PCR assay was highly specific and could specifically amplify DNA from donkey rather than cattle， sheep， pig， horse， camel， deer， dog， rabbit， chicken， duck， pigeon and quail. It was sensitive. The limit of detection for donkey DNA was 100 fg/μL and the sensitivity was 0.01%. This method was widely applicable and useful for the detection of donkey-derived ingredients in processed meat.

Keywords： TaqMan real-time polymerase chain reaction； raw and processed meats； donkey-derived ingredients； specificity； sensitivity

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201804011

中图分类号：TS251.7 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2018）04-0062-06

肉类是人类膳食的重要组成部分，肉中富含蛋白质、矿物质、碳水化合物、脂肪和维生素等，这些成分对人类健康至关重要[1]。由于丰富的营养价值以及日益增长的生产量和消费量，肉类成为食品加工和流通领域中掺假事件的主要目标，一些不法商贩和企业在牛肉、羊肉、鹿肉等高价肉制品中掺杂鸡肉、鸭肉等低价原料肉，将低价肉或非肉成分经香精处理后冒充高价肉，这种“掺杂使假”行为对人类健康、消费者利益以及民族宗教等方面都有巨大威胁，甚至会损害国家形象[2]。还有一些商家为谋取利益隐瞒或更改说明书，甚至生产假冒伪劣产品[3]。而动物源性成分检测能够应对这些问题，起到保护消费者合法权益、维护民族利益、尊重宗教信仰以及防止牛海绵状脑病[4]、传染性海绵状脑病、疯牛病、口蹄疫等人畜传染病传播的作用[5]。

目前，动物源性成分检测技术大多数都是建立在对样品蛋白质、DNA、脂肪酸等分子结构、序列或组成特异性分析的基础上，涉及到的技术手段包括酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）[6-10]、电泳[11-12]、色谱[13]、质谱[14]、生物传感分析[15-16]和聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）[17-18]等。DNA是一种相当稳定的有机分子，其在强烈的热处理之后仍能保持稳定性[19]。以DNA为基础的PCR以其快速、高灵敏度、强特异性、动态检测范围较大、易自动化及能够减少交叉污染风险等优点成为近年来的研究热点，尤其是TaqMan实时荧光定量PCR法，它能够通过实时监测每个循环的扩增产物而实现定性或定量检测。

驴肉具有高蛋白、低脂肪、高氨基酸、低胆固醇的特点，其胆固醇和脂肪含量均低于牛肉和猪肉，而氨基酸和不饱和脂肪酸含量均高于后者，且驴肉肌纤维最细[20]，是高血压、肥胖症、动脉硬化患者和老年人最理想的营养品[21]。由于驴生长周期较长，导致驴肉资源缺乏，其价格不断攀升[22]，许多不法商户为追求利润，使用小牛肉、马肉、骡子肉，甚至猪肉、鸡肉或鸭肉冒充驴肉进行销售，严重损害了广大消费者的权益。目前我国对各类动物源性食品进行定性或定量检测的标准屈指可数，更缺乏TaqMan實时荧光PCR法检测驴源性成分的报道[23]。因此，研究简易、灵敏、低成本的驴肉掺假检测方法，为相关国家标准的制定提供科学依据刻不容缓。本研究根据SN/T 3730.4—2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第4部分：驴成分检测 实时荧光PCR法》[24]设计引物和探针，建立鲜肉及加工肉制品中驴源性成分的TaqMan实时荧光PCR检测方法，旨在灵敏、准确、快速地检测出驴源性成分，规范食品市场。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜肉及加工肉制品购于锡林浩特市德克隆超市。鲜肉包括驴肉、牛肉、羊肉、猪肉、马肉、骆驼肉、鹿肉、狗肉、兔子肉、鸡肉、鸭肉、鸽子肉和鹌鹑肉；加工肉制品包括五香驴肉、羊肉干、牛肉干、肉粒多猪肉肠、马肉干、卤香水牛肉、卤汁牦牛肉干、熏兔肉、鹌鹑蛋、鸡蛋和鸭脖。样品采集后去除明显脂肪，并用灭菌水清洗，置于-20 ℃保存。

TransStart Probe qPCR SuperMix 北京全式金生物技术有限公司；qPCR引物和探针合成 北京睿博兴科公司。

1.2 仪器与设备

5418R高速台式离心机 德国Eppendorf AG公司；Nanodrop 2000c核酸蛋白测定仪 美国Thermo Fisher公司；7300 plus实时荧光PCR扩增仪 美国ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 引物和探针合成

根据SN/T 3730.4—2013，委托北京睿博兴科公司合成引物和探针。引物与探针序列如表1所示。

1.3.2 样品DNA提取

取少量（约100 mg）鲜肉及加工肉制品，用剪刀剪碎或进行研磨处理，利用溴化十六烷三甲基铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法[25-26]提取其DNA，方法如下：称取适量预先处理好的样品约50 mg，置于1.5 mL离心管中，加入DNA裂解液800 mL，旋涡混匀，65 ℃金属浴30 min，期间不时振荡混匀；在13 000 r/min条件下离心5 min，轉移上清液于洁净离心管中，加入等体积三氯甲烷-异戊醇（24∶1，V/V）混合液，充分混匀，13 000 r/min条件下离心5 min；取上清液于新的离心管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀，13 000 r/min条件下离心5 min；弃去上清液，用75%乙醇洗涤沉淀1 次，晾干，加入适量的ddH2O溶解，利用Nanodrop 2000c核酸蛋白分析仪测定其浓度。将母液稀释至100 ng/mL左右，保存于-20 ℃，备用。

1.3.3 反应体系与反应条件

反应体系：TransStart Probe qPCR SuperMix 10 mL、左右引物各1 mL、探针1 mL，模板DNA 2 mL，补水至20 mL。

反应条件：94 ℃、1 min，1 个循环；94 ℃、34 s，60 ℃、45 s，40 个循环，在每次循环退火时收集荧光。

1.3.4 特异性实验

分别取驴、牛、羊、猪、马、骆驼、鹿、狗、兔、鸡、鸭、鸽子、鹌鹑13 种动物的鲜肉组织，提取其DNA，进行特异性检测实验。采用荧光定量PCR方法，根据各反应体系循环阈（cycle threshold，Ct）值的不同来验证引物和探针对于不同动物DNA模板的特异性。

1.3.5 检出限及灵敏度测定实验

将质量浓度为100 ng/mL的驴肉原液模板DNA加灭菌ddH2O稀释，共稀释7 次，使其质量浓度分别为100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1、0.000 01 ng/mL，以不同稀释度的样品DNA为模板进行荧光定量PCR扩增反应，反应条件同1.3.3节，进行灵敏度测定。

将驴肉DNA与马肉DNA以一定比例混合，使其中驴肉DNA的含量分别为10.00%、1.00%、0.10%和0.01%，按照1.3.3节中的反应体系对方法灵敏度进行分析。

1.4 数据处理

利用ABI 7300 plus实时荧光PCR扩增仪自带的分析软件进行扩增曲线和Ct值分析。数据均以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 特异性实验结果

由表2和图1可知，在荧光定量PCR检测中，只有驴肉样品出现特异性扩增曲线，其他12 种动物的基因组DNA均未出现典型扩增曲线，且5 个驴肉样品的Ct值分别为17.73±0.16、18.38±0.14、18.56±0.10、18.70±0.18和18.54±0.24。

泳道M. 100 bp DNA Marker；泳道1～5. 驴肉DNA；泳道6～17. 分别为牛肉、羊肉、猪肉、马肉、骆驼肉、鹿肉、狗肉、兔肉、鸡肉、鸭肉、鸽子肉和鹌鹑肉的DNA。

由图2～3可知，提取的DNA及扩增产物均未出现降解，表明以上分析结果能证明实验结果的真实性和可靠性。最后对驴肉模板DNA实时荧光定量PCR的扩增产物进行测序，通过对测序结果与NCBI进行比对，发现与野驴Gina线粒体基因（Accession No.：MG885769.1）的一致性为100%。

2.2 检出限及灵敏度测定结果

2.2.1 检出限

由图4和表3可知：稀释至0.000 1 ng/μL（即100 fg/μL）的驴基因组DNA样本出现典型扩增曲线，Ct值为37.27±0.36；当稀释至0.000 01 ng/μL（即10 fg/μL）时，驴基因组DNA样本中未检测出驴源性成分，说明驴特异性引物和探针的检出限可达100 fg/μL。

2.2.2 灵敏度

由图5和表4可知，当DNA混合物中驴肉DNA的含量为0.01%时有典型的扩增曲线，且Ct值为30.97±0.40，上述结果充分表明本研究中的探针和引物具有较高的灵敏度。

2.3 定量检测

利用荧光定量PCR仪自带软件，根据驴DNA质量浓度的对数值与其对应的Ct值的线性关系，得到特异性探针的标准曲线为y=-3.334x+43.985（R2=0.996 9），说明本研究中的引物和探针具有较好的定量检测能力。

2.4 加工肉制品的检测

提取从超市购买的五香驴肉、羊肉干、牛肉干、肉粒多猪肉肠、马肉干、卤香水牛肉、卤汁牦牛肉干、熏兔、鹌鹑蛋、鸡蛋和鸭脖的DNA，对其进行荧光定量PCR（TaqMan探针方法）扩增实验。由表5可知，只有驴肉制品出现特异性扩增曲线，且Ct值为15.01±0.09，其余制品均未检出驴源性成分，说明本研究中的引物和探针具有较高的适用性及特异性，可用于市售制品中驴源性成分的检测。

3 讨 论

本研究建立了用于检测市售鲜肉及肉制品中驴源性成分的TaqMan实时荧光定量PCR法，与常用的常规PCR法相比，将检测周期从至少4 h减少至1 h左右，检测效率提高了3 倍，免去了常规PCR检测鉴定可疑阳性样品必须进行的酶切、电泳和DNA测序等步骤，并且检测过程中在封闭体系中进行扩增，降低了PCR产物被污染的可能性[27-29]。

本研究根据出入境检验检疫行业标准SN/T 3730.4—2013合成引物和探针，但是在标准的基础上拓展了特异性、灵敏度和检出限等的检测，并在此基础上进行定量分析，即通过标准品绘制标准曲线，对待测DNA进行绝对定量，快速分析出样品中是否含有驴源性成分及其含量和比例。

首先以驴、牛、羊、猪、马、骆驼、鹿、狗、兔、鸡、鸭、鸽子和鹌鹑等13 种动物的基因组DNA为模板进行特异性实验，其中牛、羊、马等动物与驴具有较高相似度，且马和驴的DNA序列具有高度同源性，使得马和驴的区分充满挑战性[30]。实验结果表明，没有交叉扩增情况出现，证明了引物和探针的高度特异性。其次，对驴组分DNA进行梯度稀释，检测其最低检出限，结果表明，当驴组分DNA达到100 fg/μL级时也能成功被检测到，并且所制作的标准曲线的R2>0.99，表明可行度和线性关系较好。然后，将马肉基因组DNA与驴肉DNA混合，使驴肉DNA的含量分别为10.00%、1.00%、0.10%和0.01%，结果表明，当驴肉DNA含量为0.01%时也有明显的扩增曲线，其Ct值约为30，表明引物和探针组合具有较高的灵敏度。在已有研究中，付理文等[31]通过猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅6 种动物的基因组，开发出六重荧光定量PCR方法，检测灵敏度达pg级；张驰等[32]开发出一种鸭源性成分检测方法，检测灵敏度达1.78 pg/μL；程欣等[33]通过研究鸡、鸭、驴、牛等11 种动植物的基因组，建立了用于检测鸭源性成分的荧光定量PCR方法，检测灵敏度达0.5 pg/μL；卞如如等[34]建立了同时检测驴、马和狐狸源性成分的四重实时荧光PCR方法，检测灵敏度为0.01 ng/μL；Tanabe等[35]建立了定量检测食品中猪肉、鸡肉、牛肉、羊肉和马肉的实时定量PCR方法，检测灵敏度达100 pg/μL；Zhang等[36]应用TaqMan实时荧光PCR方法定量检测肉、乳和奶酪中的牛源性成分，检出限为35 pg/μL。上述研究中的检出限和灵敏度均低于本研究。最后，对市售肉制品进行了驴源性成分检测，检测结果与肉制品标签一致，说明本研究中的引物和探針组合具有广泛适用性。综上所述，以本研究中的引物和探针为基础的检测方法为肉及肉制品中驴源性成分的检测提供了技术保障，本研究中的方法具有较高的特异性、灵敏度及较广泛的适用性，也是预防人畜传染病传播、防止不法商家掺假牟利的有效手段。

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