儿茶素抑制Aβ1-40的SH-SY5Y细胞毒性作用研究

刘彦霞, 王佳月, 戴雪伶, 孙雅煊

(北京联合大学 生物活性物质与功能食品北京市重点实验室, 北京 100191)

阿尔茨海默病(AD)是一种与年龄相关的神经退行性疾病，患者的认知功能及记忆功能逐渐减退[1]。AD发病机制迄今仍不明确，其涉及的发病机制有多种: 中枢神经递质代谢障碍、Aβ沉积、tau蛋白过度磷酸化、氧化应激、钙代谢平衡失调及基因突变等[2]。Aβ是由淀粉样蛋白前体(APP)在β分泌酶和γ分泌酶的作用下裂解形成的肽，由39～43个氨基酸残基组成。APP经过β分泌酶和γ分泌酶的水解能够产生Aβ1-40、Aβ1-42，研究发现生物体内Aβ1-40的产生量高于Aβ1-42[3]。但后者比前者更容易聚集，触发Aβ级联反应。近年来的研究发现，可溶性的寡聚Aβ神经毒性比纤维状的Aβ更大[4]。

目前淀粉样蛋白级联假说在 AD 发病机制研究中占据主导地位，该假说认为Aβ是导致阿尔茨海默病的主要原因。然而，至今还没有以Aβ为靶点安全有效的药物[5-6]。近些年，自然界中生物活性物质以其生理活性强且毒副作用小而受到关注，如姜黄素、大蒜素、壳寡糖及儿茶素等[7-9]。儿茶素类物质存在于许多植物中，如茶叶、葡萄中含量尤为丰富。已有大量研究证实儿茶素有诸多生理功能，如抗氧化、抗炎、抗肿瘤等[10-11]。流行病学调查结果显示摄入富含儿茶素的食物能够降低神经退行性疾病的发病率[12]，但儿茶素的作用机制尚不清楚，可能涉及对Aβ神经毒性的抑制作用。

神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞，分化程度较低，其形态及生理功能类似于正常的神经细胞[13]。本研究建立Aβ1-40损伤SH-SY5Y 细胞的模型，对儿茶素抑制Aβ1-40的细胞毒性作用进行研究，为儿茶素在神经系统疾病预防方面的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

细胞系与药物 SH-SY5Y细胞购于中国医学科学院；Aβ1-40(纯度98.58%,吉尔生化)、儿茶素(≥98%,中国药物与生物制品鉴定所)、二甲基亚砜(DMSO)购于Sigma；四甲基偶氮唑盐(MTT)购于Invitrogen 公司；乳酸脱氢酶(LDH)活性测剂盒、活性氧(ROS)检测试剂盒、Bradford蛋白含量检测试剂盒及Caspase 3活性检测试剂盒购于碧云天公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

SH-SY5Y细胞经过复苏之后，放置于温度为37℃、CO2浓度为5%的培养箱中进行培养。所用培养基构成为：1640培养基+10%小牛血清(V/V)+1%链霉素-青霉素溶液(V/V)，每2～3 d进行一次传代，药物处理组使用不含血清的培养基。

1.2.2 药物配制

将儿茶素溶于DMSO中，配制成浓度为10 mmol/L的母液，-20℃保存，实验中用细胞培养液稀释至所需浓度。将1.8 mg Aβ1-40溶于600 μL六氟异丙醇中，超声15 min，充分溶解，分装为7管，然后在氮吹仪下吹干，-20℃保存。临用时溶于600 μL纯水中， 37℃孵育 24 h，用无血清培养基将药物稀释至需要浓度。

1.2.3 细胞存活率测定方法

细胞的生存能力采用 MTT法进行测定，按0.8×104个细胞/孔的细胞密度于96孔板中培养，每孔中完全培养基体积为100 μL，培养24 h后加入药物处理，培养一定时间后，每孔加入1/10体积(10 μL) 浓度为5 mg/mL 的MTT溶液 (终浓度为 0.5 mg/mL)，于 37℃含 5% CO2的培养箱继续培养 4 h，然后小心将每孔中的培养基吸取出来，在每孔中加入 DMSO 150 μL，用移液枪轻轻吹打，使得甲瓒结晶充分溶解。在酶标仪上选定波长 562 nm(参比波长 630 nm)，测定每孔 OD 值，计算各组细胞的存活率。

1.2.4 乳酸脱氢酶活性测定方法

乳酸脱氢酶是一种糖酵解胞质酶，能催化乳酸生成丙酮酸。在细胞膜受到损伤的情况下，乳酸将会由细胞质被释放到培养液中[14-15]。乳酸脱氢酶活性检测原理为：乳酸脱氢酶的作用能够将乳酸和 NAD还原，生成丙酮酸与 NADH， NADH 与INT(2-p-iodoph enyl-3-nitrophenyl tetrazolium chloride)在硫辛酰胺脱氢酶(diaphorase)的进一步催化下，生成 NAD+与强生色物甲臜(formazan，其最大吸收波长为 490 nm)，此物质的吸光强度与样品中 LDH 的含量成正比。实验中将SH-SY5Y细胞按 0.8×104个细胞/孔的密度种植于 96 孔板中，加药处理，然后测定细胞培养液中 LDH 的含量，比较不同处理组间的相对吸光强度。

1.2.5 细胞内活性氧水平的测定方法

此方法是利用荧光密度法来检测细胞内 ROS的水平，其检测原理为：二氯二氢荧光素二乙酸酯(Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate, DCFH-DA)可以自由穿过细胞膜，DCFH-DA本身虽然没有荧光，但是当其进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解，生成不能自由透过细胞膜的二氯二氢荧光素(Dichloro-dihydro-fluorescein, DCFH)。而细胞内的 ROS可以氧化本无荧光性的DCFH， 产生具有荧光特性的二氯荧光素(Dichloro-fluorescein, DCF)，通过检测 DCF 的荧光密度就可以检测出细胞内活性氧的水平。SH-SY5Y细胞按 0.8×104个细胞/孔的密度种植于96 孔板中，于37℃培养箱中进行培养。药物处理后，加入 DCFH-DA 探针(终浓度为 10 μmol/L)，孵育0.5 h之后，用 PBS 清洗 3 次，然后加入无酚红培养液，在荧光显微镜下 485 nm 波长激发，记录 530 nm 处的荧光光密度值，比较不同组相对光密度值。

1.2.6 Caspase 3活性检测方法

Caspase蛋白酶家族在细胞凋亡过程中起重要作用， Caspase 3是细胞凋亡过程中的一个关键酶[16]。Caspase 3的检测原理为：Caspase 3可以催化底物Ac-DEVD-pNA(acetyl-Asp-Glu-Val-Aspp-nitroanilide)，产物为呈现黄色的pNA (p-nitroanilide)，pNA在波长为405 nm附近有较强吸收，所以通过测定波长405 nm处的吸光度来检测pNA的生成量，即代表Caspase 3的活性。本实验将SH-SY5Y细胞按 5×105个细胞/孔的密度培养于 6 孔板中，药物处理后，按照试剂盒要求提取总蛋白，用Bradford法测定蛋白浓度，检测不同处理组在405 nm波长下的吸收值，计算各处理组Caspase 3的相对活性。

1.3 数据分析方法

结果均采用SPSS12.0软件进行统计处理，每个样品至少测3次，每次5个重复。不同药物处理的显著性差异采用单因素方差分析(ANOVA)和Duncan检验。显著差异水平设定为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 不同浓度DMSO对细胞存活率的影响

儿茶素溶于水，但在冷水中溶解度较低，所以本实验采用DMSO作为其助溶剂，并对其对细胞存活率的影响进行了研究。由图1可见，随DMSO浓度的增加，细胞存活率表现出剂量依赖性降低。DMSO浓度在0.05%时，细胞存活率为(100.12±12.70)%，略高于对照，但无显著性差异。DMSO浓度为0.1%时，细胞存活率为(91.36±7.31)%，与空白无显著差异。浓度为0.15%时，细胞存活率为(81.75±7.30)%，当浓度为0.2%、0.25%时细胞存活率分别为(63.05±4.82)%和(52.93±2.27)%，显著低于空白。故选择DMSO浓度0.1%进行后续实验。

2.2 Aβ损伤浓度的选择

本试验对Aβ处理后，采用不同浓度的Aβ(0、2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5和20 μmol/L) 作用于SH-SY5Y细胞，用MTT法对细胞存活率进行检测，选择合适的Aβ细胞损伤浓度。根据图2可以看出，在设置的0.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5和20.0 μmol/L各组不同浓度Aβ处理组中，当Aβ作用浓度为10.0 μmol/L及以上时，与对照组相比存在显著差异 (P<0.05)。本实验中选取10.0 μmol/L Aβ进行后续实验。

图1 不同DMSO浓度对SH-SY5Y细胞存活率的影响Fig 1 Effect of DMSO concentration on cell viability of SH-SY5Y

“*”表示与空白组相比有显著性差异(P<0.05)；“**”表示与空白组相比有显著性差异(P<0.01)

图2 不同Aβ浓度对SH-SY5Y细胞存活率的影响Fig 2 Effect of Aβ concentration on cell viability of SH-SY5Y

“*”表示与空白组相比有显著性差异(P<0.05)

2.3 儿茶素不同作用浓度对细胞存活能力的影响

儿茶素是一种具有抗氧化活性的物质，但作为一种外源物质，其本身对于细胞的存活能力是否有影响？本实验采用MTT检测法对不同浓度儿茶素(0、2.5、5、10、20、40、80和100 μmol/L)对SH-SY5Y细胞的存活能力的影响进行测定，结果如图3所示：从2.5至80 μmol/L各儿茶素处理组与对照之间细胞存活能力均无显著性差异，而100 μmol/L儿茶素处理组细胞的存活率较对照组显著降低(P<0.05)。后续实验采用儿茶素5和10 μmol/L两个作用浓度进行。

图3 不同儿茶素浓度对SH-SY5Y细胞存活率的影响Fig 3 Effect of Catechin concentration on cell viability of SH-SY5Y

“*”表示与空白组相比有显著性差异(P<0.05)

2.4 儿茶素对Aβ损伤SH-SY5Y细胞存活能力的影响

预先用儿茶素保护细胞4 h后，用10 μmol/L Aβ损伤细胞，24 h后用MTT法检测细胞的存活率，结果如图4所示：10 μmol/L Aβ使细胞的存活率显著下降(P<0.01)，而5和10 μmol/L儿茶素预处理组细胞存活率较Aβ处理组有所提高。表明儿茶素对于Aβ所造成的SH-SY5Y细胞损伤具有预保护作用。

图4 儿茶素对Aβ损伤SH-SY5Y细胞存活率的影响Fig 4 Protection of Catechin on cell viability of SH-SY5Y damaged by Aβ

“*”表示与空白组相比有显著性差异(P<0.05)；“**”表示与空白组相比有显著性差异(P<0.01)；#表示与Aβ处理组之间有显著差异(P<0.05)

2.5 儿茶素对Aβ损伤SH-SY5Y细胞LDH释放的影响

乳酸脱氢酶是一种糖酵解胞质酶，在细胞膜损伤情况下，乳酸由细胞质被释放到细胞培养液中[15]。由图5可知，10 μmol/L Aβ处理后的细胞培养液中LDH的释放量显著高于对照(P<0.01)，5 μmol/L儿茶素预处理组LDH的释放量相对于10 μmol/L Aβ处理组明显减少(P<0.05)，10 μmol/L儿茶素预处理组LDH的释放量与10 μmol/L Aβ处理组相比没有显著下降，但数值有所减小，表明儿茶素能够降低Aβ对SH-SY5Y细胞膜的损伤。

2.6 儿茶素对Aβ损伤SH-SY5Y细胞内ROS自由基产生的影响

Aβ损伤可能会导致细胞的有氧代谢加强，致使细胞内活性氧水平的升高[17]。儿茶素类物质含有多个酚羟基，可以作为供氢体与ROS及其他自由基结合，终止链式反应，减轻氧化损伤。由实验结果(图6)可知，10 μmol/L Aβ处理后的细胞中ROS的产生量显著高于对照(P<0.01)，5 μmol/L及10 μmol/L儿茶素预处理组ROS的产生量相对于10 μmol/L Aβ处理组明显减少(P<0.01)。儿茶素可能通过抗氧化作用抑制了Aβ所诱导的神经毒性，降低了细胞ROS水平，从而提高了细胞的存活率。Ban在利用儿茶素保护Aβ25-35所诱导的PC12细胞中也得到同样的效果[18]。

图5 儿茶素对Aβ损伤SH-SY5Y细胞产生LDH的影响Fig 5 Effect of Catechin on LDH released by SH-SY5Y damaged by Aβ

“*”表示与空白组相比有显著性差异(P<0.05)；“**”表示与空白组相比有极显著性差异(P<0.01)；#表示与Aβ损伤组之间有显著性差异(P<0.05)

图6 儿茶素对Aβ损伤SH-SY5Y细胞产生ROS的影响Fig 6 Effect of Catechin on ROS produced by SH-SY5Y damaged by Aβ

**表示与空白组相比有极显著性差异(P<0.01)； ## 表示与10 μmol/L Aβ处理组之间有显著差异(P<0.01)

2.7 儿茶素对Aβ损伤SH-SY5Y细胞Caspase 3活性的影响

Caspase 家族是细胞凋亡过程中的关键元件，其激活与超常表达均引起细胞凋亡，因此又称死亡蛋白酶，可通过与众多蛋白因子的相互作用调控细胞凋亡[16]。Caspase-3 处于凋亡有序级联反应的下游，是最重要的效应型 Caspase，是 Caspase家族中最重要的凋亡执行者之一，是细胞凋亡的关键执行者，是细胞凋亡过程中的主要效应因子，是多种凋亡刺激信号传递的汇聚点，它的活化是凋亡进入不可逆阶段的标志[16]。本实验中，10 μmol/L Aβ处理后的细胞caspae 3的活性显著高于对照(P<0.05)，5 μmol/L及10 μmol/L儿茶素预处理组caspae 3的活性相对于10 μmol/L Aβ与对照没有显著差异(图7)。 表示儿茶素可能通过抑制细胞凋亡途径而削弱了Aβ所诱导的神经毒性,与Ruan在对儿茶素保护进行研究时得到的结果一致[19]。

图7 儿茶素对Aβ损伤SH-SY5Y细胞caspase3 酶活力的影响Fig 7 Effect of Catechin on caspase 3 activity produced by SH-SY5Y damaged by Aβ

“*”表示与空白组相比有显著性差异(P<0.05)

3 结论

根据实验所得结果，一定浓度的Aβ1-40处理能够导致SH-SY5Y细胞的存活能力下降，加剧细胞膜的通透性，并导致细胞内ROS水平升高，细胞凋亡通路中关键蛋白Caspase 3的活性增强。而儿茶素类物质的预保护，能够抑制由Aβ1-40所导致的SH-SY5Y细胞生存能力的下降以及细胞膜通透性的降低。这可能与儿茶素的分子结构有关，儿茶素类物质的多羟基结构，尤其是B环邻二酚羟基结构使其具有强抗氧化活性，能够清除自由基、螯合金属离子，从而缓解细胞内氧化压力。同时，儿茶素可能还通过对细胞凋亡途径中关键蛋白活性的调节来减少细胞死亡。