基于配方配伍药效学及正交试验优选复方哈蟆油片配方组成及工艺参数

贾学娇，孙敬蒙，郭 毅，卢美彤，张炜煜

（长春中医药大学，长春 130117）

慢性疲劳综合征可归属于中医学“虚劳”范畴。据WHO调查[1-2]显示，全球有35%以上的人处于疲劳状态，而中年男性占比达60%。促进疲劳的恢复和延缓疲劳的发生一直是运动医学、保健医学等学科的研究热点。黄芪、红景天、哈蟆油均为卫生部批准的药食两用药材。通过文献查阅及史料记载证明，黄芪[3-7]、红景天[8-11]、哈蟆油[12-15]3味药材均具有较好的缓解体力疲劳作用。笔者依据2015版《中华人民共和国药典》确定用量适用范围，采用动物配方配伍药效实验优选配伍及用量，通过正交试验优选复方哈蟆油片的提取工艺，从而为成型工艺及大生产提供参数。

1 仪器与材料

1.1 材料 红景天（购于亳州万草堂中药饮片有限公司，批号：141220）、黄芪（购于亳州万草堂中药饮片有限公司，批号：140601）、哈蟆油（购于长白山生态食品有限公司，批号：150501）；红景天苷（中国食品药品检定研究院，批号：110818-201407）；黄芪甲苷（中国食品药品检定研究院，批号：110781-200613）；正丁醇、氨水为分析纯；甲醇、乙腈均为色谱纯。

1.2 仪器与器材 Agilent 1200 Series高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）； AR2140型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；JA5301N电子精密天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）KQ2200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH.S21-Hi6电热恒温水浴锅（北京市长源实验设备厂）；电子称、游泳箱（自制），铅皮等。

1.3 实验动物 SPF级ICR雄性小鼠100只，体质量18～22 g，购于长春亿斯实验动物技术有限责任公司，合格证号：SCXK（吉）-2016-0003，实验前适应性饲养1周。

1.4 配方配伍药效试验提取物的制备1.4.1 黄芪-红景天 称取黄芪、红景天共62.1 g，加入8倍于药材量水煎煮3次，1.5 h/次，过滤，合并滤液，浓缩体积至120 mL以下，放冷，加入5.355 g黄芪细粉，混匀，用生理盐水定容配置成实验用高、中、低组浓度的混悬液，即得。

1.4.2 黄芪-哈蟆油 称取黄芪48.8 g，加入8倍于药材量水煎煮3次，1.5 h/次，过滤，合并滤液，浓缩体积至120 mL以下，放冷，加入5.355 g黄芪细粉及1.47 g哈蟆油细粉，混匀，用生理盐水定容配置成相应浓度的混悬液，即得。

1.4.3 黄芪-红景天-哈蟆油 称取黄芪、红景天共62.1 g，加入8倍于药材量水煎煮3次，1.5 h/次，过滤，合并滤液，浓缩体积至120 mL以下，放冷，加入5.355 g黄芪细粉及1.47 g哈蟆油细粉，混匀，用生理盐水定容配置成相应浓度的混悬液，即得。

1.5 方法 按照《中华人民共和国药典》将人体服用剂量换算成小鼠实验剂量，分高、中、低9个剂量组；A组：黄芪+红景天（1.51 、1.18、1.015 g/kg），B组：黄芪+哈蟆油（0.92、0.885、0.867 5 g/kg），C组：黄芪+红景天+哈蟆油（1.58、1.22、1.032 5 g/kg），其中高、中、低剂量分别是临床用量的2、1 、0.5 倍[16-17]。

试验设黄芪-红景天（A）、黄芪-哈蟆油（B）、黄芪-红景天-哈蟆油（C）3个药物配伍组，每组30只。每组分别设3个亚组（每个亚组10只），另取10只动物作为阴性对照组。除阴性对照组给予等体积生理盐水外，其余各组动物分别按相应浓度灌胃给予受试药，给药体积20 mL/kg，连续给药30 d。每周称重1次，按体质量及时调整给药浓度。

1.5.1 力竭游泳试验 末次给药30 min后，称重、将小鼠尾根部负荷5%体质量的铅皮并置于游泳箱中游泳。水箱深度高于30 cm，水温（25 ±1）℃，记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，即小鼠负重游泳时间[18]。

1.5.2 给药剂量的确定 小鼠灌胃给药剂量按人体与动物的体表面积比率换算确定剂量，人体质量按70 kg，小鼠按20 g，根据Mech-Rubter公式计算。A = K·W 2/3/1 000（体质量以g计算），K为常数，小鼠为9.1。

1.5.3 统计学方法 实验数据使用SPSS 20.0软件进行统计学处理，采用χ2分析，所有数值均以均数±标准差（x± s ）表示。

1.5.4 正交试验设计 采用 L9（34）正交试验设计[19]，以黄芪甲苷及红景天苷[20]为考察指标，考察加水倍量，提取时间，提取次数对功效成分的影响，见表1。

表1 正交试验提取因素水平表

根据表1拟定 L9（34） 9组实验，每组实验称取黄芪67.5 g，红景天30 g，按上表添加相应倍量水至一定量，浸泡至无白心后，水煎，过滤，浓缩至150 mL，浓缩液备用。

1.5.5 黄芪甲苷和红景天苷含量测定

1.5.5.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，，红景天苷流动相为乙腈-水（10:90）；检测波长为275 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃ ，进样量 10 μL。黄芪甲苷以乙腈-水（32:68）为流动相；蒸发光检测器。 理论塔板数按丹酚酸 B峰计算应不低于2 000，按黄芪甲苷计算应不低于4 000。

1.5.5.2 对照品溶液的制备 红景天苷对照品溶液：取红景天苷对照品约4 mg，精密称定，置2 mL量瓶中，加甲醇溶解，稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

黄芪甲苷对照品溶液：取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每l mL含0.5 mg的溶液，即得。1.5.5.3 供试品溶液的制备 供试品溶液（测定红景天苷）：称取提取物细粉约0.1 g，精密称定，置于10 mL量瓶中，加甲醇使之溶解，超声提取30 min；加甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，即得。

供试品溶液（测定黄芪甲苷）：称取提取物细粉约0.5 g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流4 h，提取液回收溶剂并浓缩至干，残渣加水10 mL，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次， 40 mL/次，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5 mL使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱（内径为1.5 cm，柱高为12 cm），以水50 mL洗脱，弃去水液，再用40%乙醇30 mL洗脱，弃去洗脱液，继用70%乙醇80 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。稀释至一定浓度，备用。

1.5.6 方法学考察

1.5.6.1 标准曲线的建立 精密量取红景天苷对照品溶液 0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64 mL，置2 mL量瓶中加甲醇稀释至刻度，制成红景天苷标准系列溶液，黄芪甲苷对照品溶液0.033 3、0.05、0.1、0.2、0.25、0.5、1 mL分别置1 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配成不同浓度的黄芪甲苷对照品溶液。依次注入液相色谱仪测定，记录峰面积，红景天苷以色谱峰面积（Y）为纵坐标，对照品浓度（X）为横坐标，黄芪甲苷以对照品色谱峰面积（A）的对数lnA为纵坐标，对照品含量的对数lnC为横坐标，绘制标准曲线，得红景天苷及黄芪甲苷回归方程，分别为Y = 2 330.7 X - 5.047 3，r = 0.999 8；Y = 1.475 3 X+4.780 3，r = 0.999 5。结果表明，红景天苷浓度在0.02～0.67 mg/mL范围内线性关系良好，黄芪甲苷浓度在18.67～560 μg/mL范围内呈良好的线性关系。

1.5.6.2 方法学验证 本实验对红景天苷及黄芪甲苷的重复性、仪器精密度、稳定性、加样回收率进行了考察。结果表明，红景天苷重复性RSD为1.35% ，黄芪甲苷重复性RSD为2.18%，表明该方法重复性良好。红景天苷仪器精密度RSD为1.74%，黄芪甲苷仪器精密度RSD为1.55%，表明仪器精密度良好；红景天苷稳定性RSD为1.17%，黄芪甲苷稳定性RSD为2.69%，表明测定方法室温状态下稳定性良好。红景天苷平均回收率为100.43%，RSD为1.13%，黄芪甲苷平均回收率为100.56%，RSD值为2.09%，表明本试验方法准确可行。

2 结果

2.1 复方哈蟆油片配方对小鼠体质量变化的影响 见表2。

表2 复方蛤蟆油片配方对小鼠体质量变化的影响（n = 10）

2.2 复方哈蟆油片配方对小鼠负重游泳时间的影响 见表3。

表3 复方蛤蟆油片配方对小鼠负重游泳时间的影响（n = 10）

2.3 正交试验结果及方差分析试验结果 正交试验结果表明，各因素主次顺序为：提取次数＞提取时间＞加水倍量，且提取次数有显著性影响（P＜0.05）；由直观分析示，A因素中A2＞A3＞A1，故选择A2；C因素中C3＞C2＞C1，故选择C3；B因素中B3＞B2＞B1，B2和B3差异不明显，在A2、C1条件下，将复方提取时间1.5 h与2 h综合进行比较，差异无统计学意义，为了保证提取完全，节省时间和成本，综合考虑提取时间为1.5 h，即B2；因此确定最佳工艺为A2B2C3，即加8倍水量，提取1.5 h/次，提取3次。

3 小结

确定通过文献查阅及探索，最终色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（10:90）为流动相；柱温为30 ℃，流速为1.0 mL/min，进样量10 µL。复方哈蟆油片由黄芪、红景天、哈蟆油所组成，所用中药均为卫生部批准的药食两用药材，诸药同用，能气血双生，平调阴阳，缓解疲劳，正气充足，祛病延年。本研究结果表明，连续给予小鼠不同剂量的复方哈芪片混合提取物后，缓解体力疲劳的作用随剂量增加而逐渐增强，以黄芪+红景天+哈蟆油组的效果更明显。