头针电刺激对急性脑梗死大鼠CD40、CD40L的影响

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急性脑梗死(ACI)有着极高的致死率和致残率，严重威胁着人们的健康[1]，是继恶性肿瘤、心肌梗死后又一严重影响人类健康的疾病[2]。脑梗死后中枢神经元受损，给病人带来诸多问题，因此，积极开展新型有效的治疗手段，促进中枢神经功能的恢复，降低致死率及致残率，显得尤为重要。近年来，随着对脑血管病研究的深入，头针治疗作为发病后有效的治疗手段之一，早期或者超早期头针治疗对缺血脑组织的保护及修复作用和内在的作用机制成为研究的重点，对临床具有重要指导意义[3]。本研究以CD40、CD40L为切入点，通过头针电刺激干预大鼠右侧大脑中动脉闭塞(MCAO)局灶性脑缺血模型，观察脑组织中CD40、CD40L表达的变化及神经功能缺损情况，探究头针电刺激对脑梗死可能的作用机制，为头针电刺激早期治疗提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物及分组 健康雄性Wistar大鼠96只，清洁级，体重240 g～280 g，由湖北省实验动物研究中心提供，动物合格证号：[SCXK(鄂)2015 -0005]。所有大鼠在实验室常规饲养1周，自由进食、饮水，通风、自然光照，5只或6只分笼饲养。所有Wistar大鼠采用随机数字表法分为头针电刺激组、假手术组和模型对照组，每组又分为1 d组、3 d组、7 d组和14 d组4个亚组，每组8只大鼠，并用苦味酸标记编号。

1.1.2 主要实验试剂及仪器 即用型免疫组化Elivision TM plus试剂盒，购自武汉博士德生物制品有限公司；浓缩型兔抗人CD40与CD40L单克隆抗体(一抗)、酶标抗鼠/兔聚合物(二抗)，美国MILLIPORE公司生产，购自上海雅吉生物科技有限公司；DAB显色试剂盒，购自福建迈新生物技术有限公司；磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)自行配制；10%水合氯醛，实验室提供；切片机(德国ZEISS公司)；光学显微镜；医用水浴箱、酶标仪、低温电冰箱；一端经过石蜡制备后的渔线(长度：15 mm)；华佗牌一次性无菌针灸针，规格：0.20 mm×25 mm，苏州医疗用品厂有限公司生产；KDZ -Ⅱ型电针仪(扬州市凯达医疗设备)。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠模型制备 参照Zea Longa改良线栓法[4]制备右侧大脑中动脉阻塞动物模型。术前禁食、不禁水24 h，随后称重。用10%水合氯醛腹腔麻醉(0.35 mg/100 g)，大鼠完全麻醉后将其固定于操作台上，颈部皮肤常规消毒备皮，沿右颈部正中线切开1.8 cm切口，剪开阔筋膜，显露右侧胸锁乳突肌，从胸锁乳突肌和胸骨舌骨肌间向深部分离即达到颈总动脉鞘，用血管钳将颈总动脉鞘及皮下组织向两侧牵开，用玻璃分针小心分离出右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)及颈内动脉(ICA)；用手术缝合线结扎右ECA及CCA近心端，不剪断ECA，不结扎翼腭动脉，以动脉夹夹闭ICA；用6号注射器针头于右CCA结扎的远心端(距CCA分叉处2 mm～3 mm)刺入，导入栓塞线，松开ICA动脉夹，调整好插线的角度及方向，栓线经CCA顺利地进入ICA，直至右侧大脑中动脉(MCA)的起始部，稍遇到阻力即停止，长度20 mm～22 mm，说明线栓头部进入MCA，阻断血流，用缝合线系住栓塞线；确认无出血后逐层缝合，伤口局部消毒。假手术组除不结扎插线其余步骤同上。大鼠苏醒后，有以下表现即表示造模成功[5]：提尾时左侧前肢内收屈曲；右眼Horner征；爬行时向左侧划圈；左侧肢体的疼痛回缩或消失。有以上表现就可列入实验研究。

1.2.2 干预方法 头针电刺激组：参照华兴邦制定的《动物针灸穴位图谱》[6]，选取大鼠的百会穴及大椎穴，大鼠造模成功24 h后，将其俯卧并固定于操作台上，实施头针电刺激治疗。具体操作方法：首先常规皮肤消毒，用0.20 mm×25 mm毫针，取百会向前平刺0.5寸，大椎穴直刺0.5寸，两穴接入KDZ -Ⅱ型电针仪的正负两极，选择疏密波，留针30 min，刺激时长选为1次/日，每次30 min，依据术后时间确定治疗疗程分别为1 d、3 d、7 d和14 d。其余两组大鼠每天在相同时间固定于操作台30 min，不进行任何干预，疗程与头针电刺激组相同。

1.2.3 神经功能缺损评分 治疗前及治疗后第1天、第3天、第7天和第14天进行Bederson神经功能缺损评分[7]。0分：无神经功能缺损；1分：不能完全伸展左侧前肢，左腕、肘、肩关节屈曲；2分：左肩部侧推抵抗力下降；3分：活动时向左转圈；4分：不能自发行走，意识障碍。

1.2.4 样本采集 大鼠在干预第1天、第3天、第7天和第14天后，先进行评分，然后迅速脱臼处死，取出大脑，迅速分离大脑皮层，用冰冻的PBS清洗组织表面血液，取右侧大脑的颞叶组织，石蜡切片，所有蜡块均连续切片为4 μm厚度，每个蜡块切两张，进行HE染色及免疫组化检测。

1.2.5 脑组织中CD40、CD40L测量 采用免疫组化法[8]测定脑组织中CD40、CD40L的表达，将已经制备好的石蜡切片，脱蜡及水化处理后，加入1 mL EDTA(pH8.0)修复液修复抗原，然后每张切片加1滴过氧化酶阻断剂，室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化氢酶活性，PBS液冲洗4次，每次2 min，除去PBS液，每张切片加1滴正常非免疫动物血清，室温下孵育8 min，除去血清，每张切片加入一抗(工作浓度为1∶100)，室温孵育30 min，PBS液冲洗4次，每次3 min，加入二抗，室温孵育40 min，PBS液冲洗4次，每次3 min，除去PBS液，DAB显色，镜下观察3 min～10 min，自来水冲洗，苏木精复染，PBS液冲洗返蓝，DAB显色，所有切片脱水干燥，二甲苯透明，中性树脂封固，每批次均设阳性对照片1张(由试剂公司提供空白石蜡切片)，PBS液取代一抗作为阴性对照。结果判定：CD40、CD40L主要于细胞质内表达，表现为棕黄色至深棕色颗粒细胞。切片由2名病理科医师在双盲情况下评价结果，至少随机观察5个高倍镜视野(×400)。计分方式[9]：①按显色细胞数计分，阳性细胞数<10%计1分，阳性细胞数为10%～50%计2分，阳性细胞数>50%计3分；②按细胞显色深浅计分，无色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。总分数按①×②判定结果，0判断为(-)，1～2判断为(+)，3～4判断为(++)，6～9判断为(+++)。

2 结 果

2.1 各组Bederson评分 头针电刺激组Bederson评分随治疗时间延长而逐渐降低，模型对照组在治疗14 d时略有下降。头针电刺激组与模型对照组比较，治疗后第3天、第7天及第14天Bederson评分差异均有统计学意义(P<0.05)，表明头针电刺激能显著改善脑梗死大鼠神经功能缺损情况；头针电刺激组随着时间增加Bederson评分降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，表明头针电刺激对改善脑梗死大鼠肢体功能有重要作用，且随着时间延长，肢体功能改善越明显。模型对照组各时间Bederson评分比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 各组不同时间点Bederson评分比较(±s) 分

2.2 各组大鼠脑组织中CD40、CD40L表达比较 治疗后与假手术组比较，模型对照组大鼠脑组织CD40、CD40L表达均增加，差异具有统计学意义(P<0.01)；头针电刺激组随着治疗时间的延长脑组织中CD40、CD40L表达明显减少，差异有统计学意义(P<0.01)。治疗14 d后头针电刺激组与假手术组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。提示头针电刺激能充分抑制脑梗死大鼠CD40、CD40L的表达，其中以治疗14 d后效果最佳。详见表2、表3。

组别n治疗前治疗后1 d治疗后3 d治疗后7 d治疗后14 d头针电刺激组327.65±0.947.60±0.931)6.72±0.861)5.48±0.771)3.56±0.651)模型对照组 327.79±0.968.82±1.07 7.94±0.98 7.44±0.92 6.87±0.83 假手术组 323.41±0.651)3.40±0.631)3.27±0.591)3.05±0.541)2.76±0.511) 与模型对照组比较,1)P<0.01。

组别n治疗前治疗后1 d治疗后3 d治疗后7 d治疗后14 d头针电刺激组327.28±0.927.07±0.901)6.36±0.841)5.15±0.731)3.09±0.611)模型对照组 327.34±0.937.31±0.94 7.55±0.93 7.13±0.87 6.56±0.82 假手术组 323.13±0.611)3.05±0.581)2.96±0.561)2.74±0.551)2.48±0.521) 与模型对照组比较,1)P<0.01。

3 讨 论

急性脑梗死是各种原因引起的脑血管血流突然减少或者中断，引起脑血管支配区域组织缺血缺氧，从而发生的一系列病理生理变化[10]。目前急性脑梗死的发病机制尚未阐明[11]，急性脑梗死引发的多种复杂的病理变化包括炎症反应、细胞凋亡、氧化应激反应及兴奋性氨基酸毒性作用等，而炎症反应作为一系列复杂病理反应的关键环节，近年来受到研究者的广泛关注[12]。在急性脑梗死发生后，可引发瀑布式的炎症级联反应从而进一步加重脑组织损伤，而其中CD40、CD40L信号通路在炎症级联反应中发挥重要调节作用[13]。CD40是一种I型跨膜糖蛋白，属于肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族，通过三聚体的形式表达在CD4+T细胞、CD8+T细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞等免疫细胞和血管内皮细胞表面。CD40L是一种属于TNF家族的Ⅱ型跨膜蛋白，通常以三聚体膜结合形式表达在CD4+T细胞表面及内皮细胞、活化的血小板等非免疫细胞表面[14]。正常情况下CD40、CD40L呈现低表达状态，而当大脑缺血缺氧时，可特异性地激活CD40、CD40L使其高效表达，放大免疫应答并促进CD4+T细胞活化，诱导白细胞介素 -12(IL -12)分泌，促进辅助性Th1细胞分化白细胞介素 -2(IL -2)和γ -干扰素(INF -γ)，介导早期炎症反应[15]，还可诱导单核 -巨噬细胞系统产生白细胞介素 -1(IL -1)和TNF，导致血管内皮细胞损伤，使其分泌大量的INF -γ和其他炎症细胞因子，同时CD8+T细胞在CD4+T细胞辅助下，通过CD40、CD40L系统共刺激信号通路对于激活T细胞及募集白细胞进入坏死脑组织，导致非特异性破坏自身组织引起炎症反应[16]。本研究中随着脑梗死的发生，脑组织中CD40、CD40L水平不断升高，由此可见检测CD40、CD40L水平可为脑梗死的治疗提供依据。

目前治疗急性脑梗死的主要手段为溶栓、抗凝、护脑以及对症治疗，针刺作为一种非药物治疗，具有疗效显著、操作简便等优点，古人云：“急则用针，缓则用药”“药之不及，针之所为”。《针灸大成》载：“卒暴中风，顶门、百会”。“初中风跌倒……不省人事，牙关紧闭，药水不下，急以三棱针刺手十二井，当去恶血……乃起死回生妙诀”。据文献报道针灸可以改善大脑局部血供及神经功能，电针治疗急性脑梗死疗效最好并且存在最佳时间窗[17]。电针通过头部腧穴，促进脑侧支循环的建立，改善脑组织的血流量，加强脑细胞的代偿能力，可使缺血受损的神经突触数目得到恢复，从而改善运动功能[18]。

本实验以CD40、CD40L为切入点，采用头针电刺激法治疗右侧大脑中动脉阻塞急性脑梗死大鼠，头针电刺激组在急性期进行头针电刺激治疗，治疗一定时间后进行Bederson评分，发现在治疗时间窗为7 d时疗效显著，14 d时更加明显，模型对照组大鼠肢体功能稍有一定的恢复，但差异无统计学意义。近年来针灸治疗急性脑梗死的作用机制已从血生化、细胞凋亡等多个角度进行研究[19]，而CD40/CD40L在急性脑梗死的发生发展中居重要地位，本实验头针电刺激组中CD40、CD40L的表达都受到了抑制，以治疗14 d时抑制效果最明显，由此可推断头针电刺激治疗可以抑制CD40、CD40L的表达，保护脑组织。

本实验对急性脑梗死大鼠进行Bederson评分及检测脑组织中CD40、CD40L的表达，并对头针电刺激疗法的疗程进行了探讨，结果表明在头针电刺激组中Bederson评分及CD40、CD40L的表达水平均减低，且治疗14 d时效果最佳。