肝内胆管癌TRIM44、基质金属蛋白酶9蛋白的表达及临床意义

彭 睿，黄晓勇，蔡加彬，柯爱武，施国明，柏斗胜,3*

1.中南大学湘雅二医院，长沙 410000 2.复旦大学附属中山医院肝癌研究所，上海 200032 3.江苏省苏北人民医院，扬州 225001

肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)是一种起源于胆管上皮细胞的肿瘤，在原发性肝脏肿瘤发病率中排名第二[1]。近年来，我国ICC发病率逐年升高，由于ICC起病隐匿，侵袭转移能力强，且缺乏有效的早期诊断标志物，除早期手术外其他治疗效果有限，患者中位生存期时间短且易转移复发[2-3]。因此，探讨ICC复发及转移过程中的分子机制，筛查新的关键分子，对于ICC肿瘤治疗及预后改善有重要临床意义。

TRIM44是Triple motif(TRIM)三基序蛋白家族成员之一，该家族成员结构各异、功能不同，但主要为E3泛素连接酶[4]。TRIM家族成员功能涉及细胞分化、细胞增殖、细胞免疫等[5-6]。研究表明：TRIM44在肺癌[7]、前列腺癌[8]、甲状腺癌[9]、食管癌[10]、肝癌[11]中高表达且表现为促癌作用，但是在ICC中的表达及临床意义不明。

基质金属蛋白酶9(MMP9)是基质金属蛋白酶家族成员之一，又称为明胶酶B，其大多数时候是无活性的前体蛋白，在细胞外蛋白酶修饰后才被活化。其作用主要是降解Ⅳ型、Ⅴ型胶原蛋白[12]，参与许多生理过程，如胚胎发育、组织分化等，也与诸多疾病密切相关，包括炎症和肿瘤[13]。在肿瘤中，MMP9降解基底膜和细胞外的Ⅳ型、Ⅴ型胶原蛋白，直接导致肿瘤细胞突破基底膜，促进肿瘤细胞侵袭、转移[14]，并且在肝癌和胰腺癌中可作为预后指标[15]。我们的前期研究[16]发现TRIM44可通过ERK1/2信号途径促进ICC细胞的侵袭转移。而ERK1/2信号在MMP9表达中发挥重要作用[17-18]。因此，本研究拟探讨TRIM44和MMP9在ICC中的表达及其相关性，并分析两者在ICC患者预后中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 组织来源及患者资料 2002～2009年复旦大学附属中山医院收治的87例ICC患者肿瘤及癌旁组织入选本研究。所有患者都进行了完整的手术切除，并有明确的病理诊断和5年随访资料。本研究获得了复旦大学附属中山医院医学伦理委员会审核批准。所有患者均知情同意。

1.2 免疫组织化学染色测定蛋白表达 87例患者的肿瘤组织芯片由上海芯超公司制作，取芯片60℃高温烘烤1 h，二甲苯脱蜡2次，每次10 min，分别用95%、85%、75%无水乙醇梯度水化，每步骤5 min，然后用PBS清洗，切片滴加3%过氧化氢孵育30 min；之后将芯片放入煮沸的EDTA(pH=8.0)的抗原修复液中20 min，然后用5%的胎牛血清白蛋白(BSA)封闭1 h，分别滴加一抗TRIM44(Proteintech，11511-1-AP，1∶400)，MMP9(Abcam，ab76003，1∶2 000)，4℃孵育12 h；第2天洗去一抗并使用属兔通用二抗室温孵育1 h，DAB显色；镜检观察至深棕色不变后放入清水终止反应，苏木精染核1 min，1%盐酸乙醇分色，反蓝；最后无水乙醇脱水，二甲苯透明风干，中性树胶封片拍照。TRIM44和MMP9阳性评分标准参照文献[16,19-20]。

1.3 统计学处理 采用SPSS 21.0软件，组间资料用χ2检验，Kaplan-Meier法分析生存曲线，单因素和多因素分析采用Cox风险回归模型，检验水准(α)为0.05。

2 结 果

2.1 ICC肿瘤及癌旁组织TRIM44、MMP9蛋白的表达 结果表明：TRIM44蛋白主要表达于细胞质(图1A)，TRIM44在ICC肿瘤中表达水平较癌旁组织更高(P<0.05)，且TRIM44在癌组织中表达异质性明显；MMP9蛋白主要表达于细胞质，在间质中少量表达(图1B)，癌组织明显高于癌旁组织(P<0.05)，且在不同癌组织中表达差异明显。

图1 ICC及癌旁组织TRIM44、MMP9蛋白的表达

A：TRIM44在ICC组织中的表达；B：MMP9在ICC组织中的表达.Original magnification：×40(原图)，×200(放大)

2.2 ICC组织TRIM44、MMP9蛋白表达的相关性 结果(图2)表明：ICC组织TRIM44、MMP9蛋白表达存在异质性；87例患者ICC组织中TRIM44、MMP9蛋白表达的阳性强度正相关(r2=0.412 6，P<0.001)。

图2 ICC 组织TRIM44、MMP9蛋白表达的相关性

2.3 ICC组织TRIM44、MMP9蛋白表达与患者预后的关系 结果显示：TRIM44表达高的ICC患者(n=36)生存率明显低于TRIM44低表达患者(n=51)，复发率则高于低表达组(图3A、3B，P=0.017、P=0.001)。与此同时，MMP9表达高的患者(n=40)生存率更低，复发率更高(图3C、3D，P<0.001)。将两个指标合并分析(图3E、3F，P<0.001)，将患者分为3组，第1组为两者均高表达组(n=19)，第2组为两者均低表达组(n=30)，剩余为第3组(n=38)。结果显示两者均低表达组的总体生存率高于其他两组(P<0.001)，而第3组和第1组之间差异无统计学意义(P=0.099)。在累计复发率方面，两者均低表达组患者的复发率明显低于其余两组(P<0.001)，两者均高表达组的复发率较第3组更高(P=0.026)。

图3 ICC组织TRIM44、MMP9蛋白表达与患者预后的相关性分析

A：TRIM44表达与ICC患者总体生存率的关系，高表达组患者预后差(P=0.017)；B：TRIM44表达与ICC患者术后复发的关系，高表达组患者复发率高(P=0.001)；C：MMP9高表达的患者生存率更低(P<0.001)；D：MMP9高表达患者复发率更高(P<0.001)；E：两者均低表达患者生存率更高；F：两者均高表达患者复发率更高

2.4 TRIM44、MMP-9表达与ICC患者临床病理因素相关性分析 结果(表1)表明：TRIM44表达高低与淋巴结转移密切相关(P=0.014)，MMP9的表达与肿瘤大小(P=0.007)、AFP水平(P=0.02)、淋巴结转移密切相关(P=0.012)。

2.5 ICC患者预后影响因素分析 结果(表2)表明：肿瘤大小(直径<5 cmvs≥ 5 cm)、肿瘤个数(单个vs多个)、淋巴结转移(无vs有)、癌栓(无vs有)、肝硬化(无vs有)、肿瘤分化(低vs高)、TRIM44表达(低vs高)、MMP9表达(低vs高)、两者共同表达(1组vs2组和3组)是影响ICC患者总体生存率和复发率的因素。多因素分析结果显示TRIM44蛋白表达、MMP9蛋白表达及两者共同表达是影响ICC患者累计复发率的独立预后因素。

表1 TRIM44、MMP9蛋白表达与ICC患者临床病理因素相关性分析

aFisher精确检验；AFP：甲胎蛋白；HBsAg：乙肝表面抗原；CA19-9：糖类抗原19-9.*P<0.05

3 讨 论

近年来ICC的发病率日渐升高，由于该肿瘤异质性强，早期诊断困难，手术外有效的治疗手段较少。针对ICC的诊断和治疗研究一直是临床上的热点[21-22]。本研究探讨TRIM44和MMP9蛋白在ICC肿瘤中的表达情况，发现TRIM44和MMP9在肿瘤组织的表达普遍高于其对应的癌旁组织，并且两者表达正相关，进一步研究结果显示两者高表达均与患者的淋巴结转移密切相关。TRIM44和MMP9同时高表达的患者生存率更低，复发率更高，两者共同低表达的患者生存率较高，总体复发率更低，并且为独立的复发因素。

TRIM44作为TRIM家族成员，是一种特殊的泛素化酶，涉及多种病理生理过程[23]。既往研究显示TRIM44在肿瘤常呈过表达情况，并且可通过AKT-NF-κB信号通路促进肿瘤发生发展[7,11,24]。我们的前期研究中发现TRIM44也可以影响ERK1/2信号通路[16]。另外我们前期报道UHRF2在ICC中的表达及作用，尽管该分子也能作为潜在的ICC诊断标志物，但本研究考虑MMP9和肿瘤侵袭转移密切相关，而前期研究也认为TRIM44和肿瘤侵袭转移有关。因此，本研究进一步分析了TRIM44、MMP9表达的相关性，结果显示TRIM44和MMP9表达正相关。结果提示TRIM44可能和MMP9表达有着密切关系，未来研究拟在TRIM44干扰和过表达的细胞株内验证MMP9的表达水平，并且通过免疫共沉淀法检测两者是否有直接相互作用关系。

综上所述，TRIM44和MMP9在ICC肿瘤中的表达上调显示其与ICC肿瘤发展密切相关，联合两者表达情况可为ICC患者复发和预后评估提供参考。