血管钙化模型大鼠salusin -α表达的实验研究

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血管钙化是动脉粥样硬化、糖尿病和高血压等多种疾病的病理生理基础[1]，出现在血管损伤和冠状动脉疾病中，是动脉粥样硬化的必然特征之一[2]，血管钙化与生理性骨质形成类似，是主动的、可调节的过程[3]，但具体机制尚未完全阐明。既往研究表明，许多血管活性因子参与血管钙化的过程，本课题组前期实验亦发现一些心血管活性因子参与血管钙化的发生和发展，如尾加压素Ⅱ、炎症因子及醛固酮等[4 -6]，因此，新的血管活性肽对血管钙化的机制研究及防治具有重要意义。

salusins是由28个氨基酸组成的salusin -α和20个氨基酸组成的salusin -β两种活性单体组成。salusin -α作为一种新的血管活性肽可参与高血压、动脉粥样硬化[7]等多种心血管疾病的发病过程，但是否参与血管钙化的发生和发展，目前国内外尚无报道，本研究通过制作维生素D3与尼古丁诱导的大鼠血管钙化模型上，观察salusin -α在血浆和主动脉组织中的表达，初步探讨其在血管钙化中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及药品 8周龄雄性SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司 [动物许可证号：SCXK(京)2012 -0001]。尼古丁购自Merck公司，维生素D3购自Sigma公司，钙离子测试盒、碱性磷酸酶(ALP)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；salusin -α试剂盒购自北京华英生物研究所。其余为进口或国产分析纯试剂。

1.2 血钙钙化动物模型制备 参照文献[8]制备大鼠血管钙化模型，取16只雄性SD大鼠，体重160 g～180 g，随机分为钙化组和对照组各8只。钙化组：08:00维生素D33×105IU/kg肌肉注射， 同时尼古丁25 mg/kg溶于1 mL花生油灌胃， 18:00重复灌胃1次。对照组：类似钙化组操作，但采用肌肉注射生理盐水和单纯花生油灌胃。两组大鼠常规饲养4周后，用3%水合氯醛腹腔麻醉，心脏取血，置入含有乙二胺四乙酸(EDTA)和抑肽酶的试管中，4 ℃离心分离血浆；摘取5 mm 胸主动脉，用冰生理盐水冲洗后，部分石蜡包埋用于染色，-80 ℃储存待测。

1.3 Von Kossa染色 将大鼠胸主动脉组织进行石蜡包埋、切片，行常规脱蜡、脱水后浸入5%硝酸银溶液中，紫外线下照射30 min，再用2.5%硫代硫酸钠溶液处理1 min定影，然后依次用0.25%碱性品红复染，经脱水、透明、封片，在光镜下观察。

1.4 血管组织ALP活性及钙含量测定 将大鼠主动脉组织置于液氮中研磨，4 ℃ 3 000 r/min离心10 min，取上清以考马斯亮蓝法行蛋白定量。分别按照ALP 测定试剂盒及钙测试盒(甲基百里香酚蓝比色法)说明书测定主动脉ALP 活性及钙含量。

1.5 salusin -α含量的测定 取血浆约200 μL及主动脉组织约50 mg(用锡纸包裹)，干冰低温保存下送北京华英生物研究所检测，采用放射免疫法检测，具体按说明书进行。

2 结 果

2.1 血管钙化大鼠模型的特征 Von Kossa染色可见主动脉中膜弹性纤维间黑色颗粒沉积，表明钙盐沉积。详见图1。

黑色颗粒为钙盐沉积。

图1大鼠主动脉Von Kossa染色(×100)

2.2 大鼠主动脉组织钙含量、ALP活性的变化 钙化组钙含量及ALP活性明显高于对照组(P<0.01)。详见表1。

表1 两组主动脉钙含量与ALP活性比较(±s)

2.3 大鼠血清和主动脉组织salusin -α含量的变化 钙化组大鼠血清和主动脉组织中salusin -α的表达明显下调(P<0.01)。详见表2。

表2 两组血清和主动脉组织salusin -α表达比较(±s)

3 讨 论

血管钙化是一个主动、可调节的过程，血管平滑肌细胞由收缩表型转变为成骨细胞样表型是血管钙化的基础。病理情况下如氧化应激、高血压、高血糖、高脂血症以及炎症反应等，可导致血管损伤，可能为血管钙化始动因素或促进因素。近年来，调节血管功能的活性因子，尤其是心血管组织产生的旁/自分泌活性肽或活性因子逐渐成为研究的热点，随着研究的深入，与血管钙化相关的多条信号通道包括转化生长因子 -β(TGF -β)、骨形态发生蛋白(BMPs)Smad通路和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路等[9 -10]也成为目前研究的焦点。本课题组前期研究发现尾加压素Ⅱ、醛固酮和部分炎症因子等活性因子的表达均与血管钙化的程度呈正相关，提示其促进血管钙化的作用与加重血管损伤或功能受损有关，且促进血管钙化因子之间对血管钙化的发展有协同作用。而国内外研究发现抑制血管钙化的因子如Intermedin[11]、Fetuin -A[12]等可保护血管功能并减轻血管钙化的程度。因此，寻找新的参与血管钙化的活性因子对于阐明血管钙化的机制及血管钙化的防治具有重要意义。

salusins具有促进平滑肌细胞和成纤维细胞增殖、降低血压并减慢心率和参与细胞内钙信号转导的效应，可能与动脉粥样硬化等多种心血管疾病有关。salusin -α作为一种新的心血管活性肽可延缓动脉粥样硬化的发病过程，有研究表明salusin -α具有舒张血管、促进细胞增殖等生物学效应[13 -14]，Watanabe等[15]发现，在培养的人巨噬细胞中，salusin -α可通过下调胆固醇酰基转移酶1的表达，抑制泡沫细胞的形成，发挥抗动脉粥样硬化的作用，其与salusin -β的作用可能刚好相反，而在本课题组前期实验研究中发现salusin -β可促进血管钙化。本实验进一步探讨salusin -α是否是心血管保护因子。

本研究发现钙化组大鼠血浆和主动脉组织salusin -α的表达明显比对照组减少，提示salusin -α参与了血管钙化的发生与发展，且可能为新的血管钙化抑制因子，这一发现将为血管钙化的机制研究及防治提供新的思路。但salusin -α抑制血管钙化的具体机制尚不十分明确，有学者认为salusin -α可能通过抑制内质网应激途径保护心肌缺血损伤[16]，后续研究将针对这一问题进行深入探讨。