AIRE因子在重症肌无力患者外周血中的表达及其影响

王圣元　肖枫林　李航

[摘要] 目的 分析自身免疫性调节因子（AIRE）在重症肌无力（MG）患者外周血中的表达及其影响因素。 方法 收集2016年1月～2017年1月空军军医大学唐都医院收治的MG患者临床资料及外周血标本，分为全身型（GMG）组（16例）、眼肌型（OMG）组（14例）、对照组（10例）。采用流式细胞术分析各组AIRE因子、Tfr细胞及Tfh细胞比值。 结果 GMG组AIRE因子阳性表达较OMG组和对照组下降（P < 0.001），而OMG组和对照组差异无统计学意义（P > 0.05）。AIRE因子阳性表达与Tfr/Tfh比值呈正相关（r=0.605，P < 0.001），而与QMG评分及临床绝对评分均呈负相关（r=-0.622，P < 0.001；r=-0.513，P=0.004）。 结论 AIRE可能参与了MG的发病过程，低水平AIRE在诱导MG发病的过程中可能起关键作用。

[关键词] 自身免疫性调节因子；重症肌无力；定量重症肌无力评分；绝对评分

[中图分类号] R746.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）05（a）-0047-04

The expression and influencing factors of AIRE in peripheral blood of myasthenia gravis

WANG Shengyuan1* XIAO Fenglin2* LI Hang1 ZHANG Yu1

1.Department of HBO， Navy General Hospital of PLA， Beijing 100048， China； 2.Department of Nephrology， Navy General Hospital of PLA， Beijing 100048， China

[Abstract] Objective To study the expression and influencing factors of AIRE in peripheral blood of MG. Methods Clinical data and peripheral blood samples of MG patients were collected at Tangdu Hospital of air force Military Medical University from January 2016 to January 2017. All data were divided into general type MG （GMG） group （16 cases）， ocular MG （OMG） group （14 cases） and control group （10 cases）. Flow cytometry was used to analyze the ratio of AIRE positive cells， Tfr cells and Tfh cells. Results The express of AIRE in GMG group was significantly lower than that in OMG group and control group （P=0.003）， but there was no significant difference between OMG group and control group （P=0.152）. The express of AIRE was positively correlated with the ratio of Tfr/Tfh （r=0.605， P < 0.001）， but negatively correlated with the QMG score and clinical absolute score （r=-0.622， P < 0.001； r=-0.513， P=0.004）. Conclusion AIRE may be involved in the pathogenesis of MG， and low level of AIRE may play a key role in the pathogenesis of MG.

[Key words] Autoimmune regulator； Myasthenia gravis； Quantitative MG score； Clinical absolute score

重症肌无力（MG）是神经系统常见的自身免疫系统疾病（AIDs），具有明确的抗原、抗体及病理作用靶点，病变累及神经-肌肉接头突触后膜上的乙酰胆碱受体[1-2]。MG发病机制与异常的免疫应答明显相关，但引起MG起病或加重的机制仍不明确[3]。

免疫性调节因子（AIRE）是一种转录因子，由胸腺髓质上皮细胞亚群产生，可以选择性的对自我耐受的T细胞受体表现出极高的亲和性并促使后者进入凋亡，避免了自身免疫的发生[4]。大量动物实验揭示出AIRE突变对获得性免疫缺陷综合征（AIDs）的易感性之间的联系，AIRE基因敲除小鼠与野生型小鼠比较对包括MG在内的多种AIDs易感[5]，表明AIRE表达对于AIDs发病起到关键作用。本研究拟对比AIRE在不同MG患者间的表达，试图分析AIRE的表达与患者基本情况、病情严重程度及Tfh细胞、Tfr细胞之间的关系，为进一步研究MG发病机制提供思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2016年1月～2017年1月就诊于空军军医大学唐都医院门诊的MG患者，对患者进行临床QMG评分及绝对评分并收集外周血标本，共入组患者30例，根据Osserman分型分为全身型MG（GMG组）患者16例，眼肌型MG（OMG组）患者14例；同期選取健康对照组10例。所得数据中男24例，女16例，发病年龄20～66岁，平均（42.08±14.20）岁。各组年龄、性别比较差异无统计学意义（P > 0.05）；MG组患者中临床QMG评分3～27分，平均（10.97±6.28）分；绝对评分2～31分，平均（13.47±6.42）分。本研究通过医院医学伦理委员会的批准，受试者知情同意并签署知情同意书。

参考中国MG诊断和治疗指南（2015年版）制定入组标准：①骨骼肌易疲劳，表现为波动性及易疲劳性；呈晨轻暮重。②新斯的明试验阳性。③肌电图低频刺激波幅递减10%以上。排除标准：①3个月内曾接受免疫抑制剂治疗；②3个月内曾接受免疫球蛋白或血浆置换治疗；③合并其他AIDs。

1.2 方法

1.2.1 临床QMG评分及绝对评分 定量MG评分量表由1983年提出，后由Tindall等[6]进行修正并扩展至13个项目，美国重症肌无力协会推荐QMG评分用于所有与MG相关的临床研究，总分0～39分；临床绝对评分由我国专家于1997年提出并应用临床，被国内MG治疗的专家共识及治疗指南收录，总分0～60分，分数越高提示MG病情越重。

1.2.2 采用密度离心法分离外周血PBMCs 将3 mL血样本与等量1640培养基（HyClone公司）充分混和，加入人外周血淋巴细胞分离液3 mL，使用离心机（贝克曼Allegra X-22R）在4℃下2000 r/m离心20 min；离心后吸出云雾层，即PBMCs层，加入5倍体积RMPI-1640溶液重悬洗涤细胞2次，保留黏附在离心管底部的PBMCs。将待测细胞加入抗人CD4抗体（Biolegend公司）和抗人CXCR5抗体（Biolegend公司）与细胞悬液充分混匀，避光孵育30 min；洗涤细胞2次后保留黏附在离心管底部的细胞。避光情况下加入1 mL固定/破膜液（Miltenyi公司）重悬，避光30 min进行细胞破膜，洗涤并重悬细胞后加入抗人AIRE抗体（Miltenyi公司）和抗鼠/人Foxp3抗体（Biolegend公司）避光孵育30 min；避光加入2%多聚甲醛500 μL固定细胞。采用FACS Calibur流式细胞分析仪（BD公司），进行流式分析。需要分析：AIRE阳性细胞占比，CD4+CXCR5+Foxp3+Tfr细胞占比，CD4+CXCR5+Foxp3-Tfh细胞占比。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验；采用相关检验Spearman检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组间AIRE表达的差异

流式细胞术的结果示意图见图1A。三组AIRE阳性表达率比较差异有统计学意义（F=10.571，P < 0.01）；AIRE因子阳性表达率GMG组[（76.25±12.73）%]较OMG组[（84.30±6.13）%]和对照组[（89.98±3.56）%]明显下降，差异有统计学意义（P < 0.001），而AIRE表达在OMG组和对照组差异无统计学意义（P > 0.05）（图1B）。

2.2 AIRE表达与Tfr细胞、Tfh细胞的相关性分析

细胞流式结果显示Tfr细胞、Tfh细胞及两者的比值见表1，AIRE因子阳性表达与Tfr/Tfh比值呈正相关（r=0.605，P < 0.001），见图2。

2.3 AIRE表达与病情严重程度、年龄、性别等相关性分析

所有30例MG患者AIRE因子阳性表达与QMG评分[（10.97±6.28）分]及绝对评分[（13.47±6.42）分]均呈负相关（r=-0.622，P < 0.001；r=-0.513，P=0.004）（图2A、B）。为了排除干扰因素，进行了AIRE因子阳性表达与年龄之间相关性分析，差异无统计学意义（r=-0.004，P=0.983）（图2C）。比较不同性别间的AIRE因子阳性表达[男性（82.37±11.26）%，女性（82.69±9.76）%]，差异无统计学意义（t=0.093，P=0.926）（图2D）。

3 讨论

AIRE主要存在于胸腺髓质上皮细胞，属于阴性选择系统，作为促凋亡因子，对存在自身抗原-抗体表现的T细胞加快其凋亡，从而阻止自反应克隆的逃逸，在免疫耐受过程中发挥重要作用[7-8]，而AIRE在外周血的作用主要是参与对抗原的识别，并通过对抗原进行修饰及递呈维护免疫系统的相对稳定[9]。结合本实验结果，GMG组的AIRE表达明显低于OMG组和对照组，而OMG组与对照组间差异无统计学意义，OMG患者因仅累计眼外肌群，其病情严重程度较GMG患者明显减轻，并且AIRE在排除干扰因素后与MG患者病情严重程度呈负相关，提示AIRE的下降与MG发病有一定的联系，低水平AIRE在诱导MG发病的过程中可能起关键作用。

本研究发现AIRE因子阳性表达与Tfr/Tfh比值呈正相关。目前研究认为，MG发病机制与异常免疫应答相关，并且体液免疫在MG发病、发展过程中起了十分重要的作用，B细胞的失调及分泌的抗体可能直接或间接导致了MG发病，但其具体的机制还不明[10]。Tfh细胞是辅助B细胞的重要细胞群，可通过相应的受体与B细胞牢固结合[11]，在促使B细胞增殖、分化等重要转变过程中起到十分重要的作用[12]。同时，Tfh细胞通过分泌IL-21协助B细胞的成熟过程，并产生大量的抗体[13]。Tfh细胞可通过细胞因子迁徙至外周组织而发挥作用，并不断通过级联反应增强B细胞的迁徙及过度强化，从而加强异常免疫反应[14]。同样动物研究发现，如果对实验小鼠进行免疫耐受使B细胞缺失，或阻断抗原呈递的过程，即便小鼠体内存在大量自反应细胞，Tfh细胞占比仍不上升[15]。可见B细胞与Tfh细胞之间可能存在重要调控机制，这一过程可能有AIRE的调控作用[16]。

Tfr细胞是Treg细胞的特殊亚群，对Tfh细胞介导的细胞活化产生拮抗作用[17]，进一步抵制抗体的产生[18]。Tfr细胞具有调节性T细胞及Tfh细胞的双重特征[19]，可通過直接或间接作用与B细胞发生关联，在Tfr细胞数量下降或功能降低时，Tfh细胞表达可上调，并使B细胞的数量上升。可见，Tfr细胞可限制Tfh细胞对免疫调节的部分功能，从而避免B细胞过度表达、增殖及迁徙，保持细胞免疫的平衡。任何异常或无序Tfr/Tfh比值，都会破坏这种平衡，导致免疫功能紊乱，使B细胞产生过度的抗体，其结果是MG的发病、发展。

AIRE对MG发病的影响机制可能较多，但主要机制是在对自反应细胞的清除，在维持免疫系统稳定的管理上[20]。AIRE和Tfh、Tfr细胞之间可能存在相互作用的机制，使T细胞及B细胞功能相继出现紊乱，逐渐形成恶性循环，进一步促使免疫功能发生紊乱，从而引起MG发病。

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（收稿日期：2018-02-01 本文編辑：任 念）