蓝光、氮源对红曲霉生长发育及色素合成的调控研究

赵永霞，谢 健，李 升，周礼红

（1.茅台学院酿酒工程系，贵州仁怀564500；2.遵义医学院遗传教研室，贵州遵义563000；3.贵州大学农业生物工程研究院，贵州贵阳550025；4.贵州大学生命科学学院，贵州贵阳550025）

蓝光是自然界中非常重要的环境因素之一。对于真菌而言，蓝光主要是信息的载体，对它们的生长代谢起着重要的调控作用，真菌通过蓝光受体[1]（一种含有核黄素的转录因子）来接收光刺激，不论蓝光带给它们的是有益的还是有害的影响，从进化角度都会增强其对环境的适应性。光调控在Neurospora crassa、Aspergillus nidulans、Aspergillus flavus、Aspergillus fumigatus、Aspergillus parasiticus、Penicillium sp.和Fusarium sp.都有研究，甚至海洋来源的丝状真菌[2]也有报道，蓝光可以激发Neurospora crassa无性生活循环，影响菌丝体类胡萝卜素的合成[3]、无性孢子的形成以及昼夜节律的方向[4]，还影响有性生活循环和原子囊壳的形成，以及其趋光性等不同的生理反应[5]。红曲霉是中国传统药食兼用菌种，可代谢产生多种生物活性物质，广泛用于酿酒、制药等领域，其生理反应、生长发育、代谢等也会受到蓝光的调控。研究报道发现，光照会影响Monascus anka菌丝的生长和孢子的形成，以及次级代谢产物的产生[6]；抑制Monascus ruberN气生菌丝的形成，影响其菌落的形态[7]；降低桔霉素的产量，抑制菌丝体过氧化氢酶的活性[8]。Tsuyoshi Miyake等人对Monascus pilosus进行研究，发现不同波长的光照对菌丝的长短、疏密、无性孢子的形成量及有性孢子的萌发都有一定的影响[9]。蓝光作为光信号可以激发上调类胡萝卜素合成途径[10-11]，增加carRA and carB基因的转录[12]。蓝光可以通过或者部分通过cAMP途径调节M.aurantiacus桔霉素代谢以及孢子生产[13]。

微生物向外界吸收营养物质是其生存所必需的，外界的铵盐浓度对真菌的生长至关重要，NH3可以通过自由扩散也可通过主动运输进入细胞[14]。铵盐培养基存在生长平衡，对铵盐的吸收可转化为生物量[14]和次级代谢产物，而硝酸盐对真菌的生长有初始抑制作用，所以没有生长平衡，而是作为储存能量，为真菌的发育提供能量[15]。光调控与氮源调控存在相关性[16]，在液体培养基中，氮源缺乏也会激发真菌的分生孢子的形成，而且受到蓝光的调控[17]。大量研究表明，蓝光和氮源对红曲霉的调控起着重要的作用，因此本课题组采用蓝光和黑暗，结合以不同氮源对Monascus anka的生长发育及色素合成进行研究，以期初步揭示蓝光、氮源对红曲霉生长发育及色素合成的调控模式。

1 材料与方法

1.1 材料

GZU4577菌株：Monascus anka，保藏于贵州大学真菌资源研究所。

沙氏琼脂改良培养基：麦芽糖5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，酵母膏5 g，琼脂20 g，水1000 mL，pH值自然，121℃灭菌25 min。用于菌种的活化和斜面培养。

无氮源Czapek培养基：K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO40.5 g，FeSO40.01 g，蔗糖30 g，琼脂15 g，蒸馏水1000 mL，pH值自然。

1.2 实验方法

向无氮源察氏培养基分别添加1%（W/L）的NH4NO3、1%NH4Cl、1%NaNO3作为氮源，氮饥饿作为对照，后续同上。

将以上不同种类调控培养基分别置于蓝光（470～480 nm），黑暗条件下，28℃连续培养9 d。灯管长115 cm，28 W，使用2个光源。

光照强度=(光源总光通量×CU×MF)/面积。

光通量：1160 lm；CU：利用系数；室内一般取0.4；MF：维护系数0.8。

培养箱长150 cm，宽110 cm，面积=150×110=16500 cm2=1.65 m2。光照强度

1.2.1 形态观察方法

每天观察菌落形态及其变化，每隔24 h数码照相机拍照，测量直径，光学显微镜观察菌丝，孢子变化及边缘菌丝的变化。培养7 d后，从菌落边缘采集菌丝3处，制片，显微镜下观察。

1.2.2 色素提取及测定方法

将培养好的红曲霉菌落置于烘箱里烘干，测定干重，研碎，置于带塞试管中，加入10 mL 80%乙醇避光浸提5 h，获得色素粗提物。稀释一定倍数后，置于酶标仪中，分别在510 nm、465 nm、410 nm测定其吸收度，以及进行全波长扫描。其中以505 nm的吸收值代表红色素，465 nm的吸收值代表橙色素，410 nm的吸收值代表黄色素。色价（U/g）计算方法：色价U/g=(OD×稀释倍数)/菌体干重。

1.2.3 孢子数计数方法

将培养9 d的平皿，用内径（d）10.00 mm的打孔器在菌落上均匀打孔，置于有玻璃珠的三角瓶内，加入若干0.2%TWeen 80溶液，漩涡振荡洗孢子，4层擦镜纸过滤，血球计数板(采用25个中方格计数板)显微镜计数分生孢子（平均4重复），未过滤，显微镜计数闭囊壳（平均4重复）。

孢子数计算：5个中方格的总孢子为A，孢子液稀释倍数为B，内径为d，则：

1.2.4 统计分析方法

采用OFFICE EXCEL 2007进行计算，分析软件SPSS Statistics17.0对所有实验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 蓝光结合不同氮源对菌落生长的影响

图1是蓝光结合不同氮源对GZU4577的菌落形态和生长的影响，表1进行了菌落形态的描述，从图1可以看出，蓝光显著抑制了菌株的径向生长。蓝光的刺激抑制GZU4577气生菌丝的形成，产生的气生菌丝较稀疏，菌落呈不规则状，菌株颜色没有发生变化。以NaNO3为氮源，蓝光显著抑制了菌株的生长，延迟了菌株变色时间（表1），推测NaNO3会抑制色素的合成。以NH4Cl或NH4NO3为氮源时，蓝光同样显著抑制菌株的生长，但是气生菌丝为白色，基质菌丝为红色，菌株变色较快，气生菌丝生长相对旺盛（图1，表1）。当以铵态氮为氮源的条件下，蓝光的抑制效应减弱。黑暗条件下的气生菌丝相对稠密，菌落呈现规则圆形，气生菌丝隆起也较高，为白色，有利于黄色素的合成，生长后期的菌落边缘出现不规则扇形（图1，表1）。

图1 Czapek培养基，添加不同氮源，考察蓝光对GZU4577形态的影响

表1 Czapek培养基蓝光对GZU4577菌落表面特征的影响

2.2 蓝光结合不同氮源对分生孢子和闭囊壳的影响

不论是蓝光条件或是黑暗条件，是否补充氮源，都能够形成分生孢子，GZUMA-4氮饥饿条件下，蓝光有利于分生孢子的形成，但是添加氮源后，蓝光反而抑制了分生孢子的产生。添加3种外源氮源后的分生孢子量之间没有显著差异，均少于氮饥饿条件。而黑暗条件下，氮饥饿则对分生孢子的产生无促进作用，添加氮源后都促进分生孢子的产生，NH4NO3为氮源时分生孢子量最大(图2)。以NaNO3、NH4Cl或 NH4NO3为氮源，蓝光抑制闭囊壳的形成，氮饥饿蓝光或黑暗条件下形成的闭囊壳数量非常的少，以致有些用显微观察仍未观察到，说明闭囊壳的形成，氮源是必需的营养物。黑暗条件在一定量的氮源存在的情况下有利于闭囊壳的形成，有利于GZUMA-4从营养生长进入到有性生殖期，且铵态氮相对于硝态氮更有利于闭囊壳的形成（图2）。

2.3 蓝光和不同氮源对色素产生的影响

从图3可以看出，蓝光调控红曲色素的合成。氮饥饿或添加氮源蓝光均抑制3种色素的合成。蓝光条件下，NaNO3与对照组无显著性差异，NH4Cl和NH4NO3均促进色素的合成。黑暗条件下，氮源均促进了色素的积累，黄色素合成最优。氮源缺乏严重阻碍了GZU4577红曲色素的合成。铵态氮源有利于色素的合成，硝态氮抑制色素的合成。不论氮饥饿或补充一定量的氮源，蓝光都抑制色素的合成。

图2 Czapek培养基不同氮源，蓝光对GZU4577孢子量的影响（9 d）

图3 Czapek培养基不同氮源，蓝光对GZU4577色价的影响

3 讨论

GZU4577生长在氮源贫乏的Czapek培养基中时，生长速率缓慢以及色素的积累都较少，外源无机氮源的作用很大，几乎直接刺激菌株的生长发育和色素的产生。蓝光对GZU4577的生长发育以及色素合成皆有负调控，同时与培养基中的氮源对菌株的生长发育及色素的合成有交叉调控。

蓝光可以通过多种途径影响真菌代谢及生长。Neurospora crassa、Aspergillus niger的菌丝形态，孢子生殖等受到蓝光的调控[18-19]。一些蓝光调控基因也受到氮饥饿的调控[17]，中间还有些基因受到昼夜节律的调控，一部分还包含在氮源代谢途径中[20]。所以说光反应和氮源代谢存在一定关系。以Czapek为基础培养基，在28℃下连续培养9 d后发现氮饥饿或者一定量的氮源存在，蓝光将会抑制菌株的径向生长和气生菌丝的形成，可能存在某种抑制机制。此外，硝酸盐也抑制菌株的径向生长，存在硝酸盐抑制效应，而且在蓝光条件下，抑制增强，这说明硝酸盐和蓝光之间有协同抑制效应。研究还发现，铵盐对菌株的径向生长有利，铵态氮尤其是NH4NO3氮源有利于GZU4577气生菌丝的形成。

光信号的感知和传递是一个及其复杂的调控网络，影响真菌的生殖、生物钟的重置以及对孢子释放等，有文献报道Phycomyces blakesleeanus在光照和重力的影响下，孢囊柄会长到几个厘米的长度[21]。早期研究表明，Aspergillus nidulans产生无性孢子，光是不可或缺的因素[22]。但是我们在黑暗条件和不同光照条件下连续培养到第9天进行孢子计数，结果证实红曲霉都可以形成分生孢子，与Aspergillus nidulans光调控机制有所不同。氮饥饿条件下蓝光有利于分生孢子的形成，与文献报道[17]中，蓝光诱导Phycomyces blakesleeanus大型分生孢子囊形成的结果一致。蓝光有利于GZU4577从营养生长进入到无性生殖，但是补充氮源后调控规律会发生变化，说明光调控会受到菌株的营养成分的影响。黑暗条件在一定量的氮源存在的情况下，有利于闭囊壳的形成，有利于GZU4577从营养生长进入到有性生殖期，且铵态氮相对于硝态氮更有利于闭囊壳的形成。黑暗也有助于GZU4577从营养生长进入有性生殖期，这与许多丝状真菌类似，如：黑暗促进一种海洋来源的Aspergillus glaucus的有性发育[2]，铵态氮也有助于从营养生长进入有性生殖，硝酸盐阻碍有性发育的转化，与Mariette Carels[23]研究结果有所不同，不同菌种接受光调控模式可能有所不同。

光照条件对生物体许多代谢都有调控作用，包括类胡萝卜素代谢、糖代谢、几丁质代谢，脂肪酸代谢及氨基酸代谢等，对许多聚酮体类代谢产物也有调控作用[24]。以Czapek基础培养基培养GZU4577菌株，无论氮源如何，蓝光均抑制色素的合成，以NH4Cl或NH4NO3为氮源时，抑制效应减弱。氮源缺乏会严重阻碍GZU4577红曲色素的合成，NaNO3氮源充足也不利于红曲色素的合成，结果与文献[23，25]报道的一致。不同的蓝光强度会影响色素的合成，采用300 lux和450 lux蓝光会降低色素的产量[25]，曾有报道完全黑暗可增加真菌色素的合成[26]，这与实验结论一致。而且不同的光照强度和光照时间对红曲霉色素的合成影响不同[27]，需要后续更深入的研究，为红曲霉的光调控机理研究奠定基础。