黄酒中“焦糖香”特征香气物质葫芦巴内酯的检测及风味贡献研究

王程成，陈双，王栋，徐岩

(江南大学，食品科学与技术国家重点实验室，工业生物技术教育部重点实验室，酿造微生物与应用酶学研究室，江苏 无锡,214122)

黄酒是我国民族特色酒精饮料，其营养丰富、风味独特，深受我国和世界消费者的喜爱。“焦糖香”是我国黄酒具有的重要感官特征，是描述黄酒香气特征的7个主要描述词之一[1]。前期有研究采用气相色谱-嗅闻技术(gas chromatography-olfactometry，GC-O)首次研究发现葫芦巴内酯是构成甜型黄酒“焦糖香”特征香气的关键香气化合物[2]，但对于我国黄酒中葫芦巴内酯的含量分布情况及其对风味的贡献还缺乏系统的研究。

葫芦巴内酯(sotolon)，又名3-羟基-4,5-二甲基-2(5H)呋喃酮，是一种香气强烈的手性内酯化合物，在空气中的阈值仅为0.02 ng/L[3]。葫芦巴内酯在食品中香气表现复杂，低质量浓度时呈现焦糖、酱油的香气特征，而在较高质量浓度时则呈现咖喱的香气特征[4]。大量研究发现葫芦巴内酯是构成众多食品(如葡萄酒、陈年日本清酒、咖啡、酱油、糖浆等)香气特征的关键香气化合物[5-7]。由于葫芦巴内酯独特的感官特征，其在酿造酒中的风味功能尤其受到关注。早在1976年DUBOIS等人首次在法国金黄葡萄酒(Vin Jaune)中发现了葫芦巴内酯的存在[8]，同年TAKAHASHI等人研究发现葫芦巴内酯是构成陈年清酒“焦糖香”特征的关键香气物质[9]。随后近半个世纪的研究逐步明确葫芦巴内酯是构成多种类型葡萄酒香气特征的关键香气化合物，如贵腐葡萄酒(Botrytised wine)[10]、雪利酒(Sherry wine)[11-12]、马德拉酒(Madeira wine)[13]、波特酒(Port wine)[14-15]等。由于葫芦巴内酯在酒中的重要风味作用，对该物质的分析监控成为很多发酵酒品质控制的重要手段。

由于葫芦巴内酯具有极性大、稳定性差，且在饮料酒中含量低，对该物质的准确分析检测具有较大的挑战。常用的固相微萃取技术、搅拌棒吸附萃取技术等样品前处理方法难以对该物质进行有效的富集。早期对该物质的检测一般采用大样品量液液萃取结合气相色谱-质谱联用技术(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)进行分析[13, 15-16]，但该方法存在有机溶剂用量大、操作繁琐、劳动强度大的缺点。陈双等人[2]开发了基于固相萃取技术(solid-phase extraction，SPE)及微管大体积进样技术(microvial insert large volume injection，LVI)联合GC-MS测定黄酒中葫芦巴内酯含量的方法，但该方法需要用到专用的设备，难以推广应用。为了研究葫芦巴内酯在黄酒中的风味贡献并对风味品质进行监控，急需开发一种简单、快速测定黄酒中葫芦巴内酯含量的方法。

因此，本研究基于液液微萃取(liquid-liquid microextraction，LLME)结合GC-MS技术建立了黄酒中“焦糖香”特征香气物质葫芦巴内酯的快速检测方法，并进一步研究了该物质在黄酒中的分布情况及风味贡献。研究结果将有助于增进对黄酒风味化学理论的认识和风味品质的控制。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葫芦巴内酯(纯度 ≥97.0%，GC)，4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮(内标，98%，GC)，戊烷(色谱纯)和正构烷烃(C5-C30)购买于Sigma-Aldrich(中国上海)公司。Na2SO4、NaCl及乙醚(分析纯)购买于中国国药上海化学试剂公司。乙醇(色谱纯)购买于百灵威科技有限公司。二氯甲烷(色谱纯)和巴斯德吸管购买于上海安谱科学仪器有限公司。实验用水为Milli-Q超纯水。

市售黄酒样品(24个样本，来自4个不同地区)。其中浙江地区共10种黄酒分别命名为Z-1、Z-2、Z-3、Z-4、Z-5、Z-6、Z-7、Z-8、Z-9、Z-10，江苏地区包括7种黄酒分别命名为J-1、J-2、J-3、J-4、J-5、J-6、J-7，上海地区包括3种黄酒分别命名为S-1、S-2、S-3，其他地区包括4种黄酒分别命名为：Q-1、Q-2、Q-3、Q-4。

1.2 仪器与设备

气相色谱-质谱联用仪：气相色谱(GC 6890N)-质谱(MS 5975)，安捷伦公司(美国)；多功能自动进样器，德国Gerstel公司；漩涡振荡仪(GENIUS 3)，IKA；氮吹仪(organomation N-EVAP)，上海安谱；电子天平，Mettler-Toledo公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

取20 mL黄酒于60 mL的样品瓶中，加入内标4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮(100 mg/L，40 μL)及20 mL饱和NaCl溶液混匀，再加入5 mL CH2Cl2作为萃取剂。将混合样品瓶放置于涡旋振荡仪上以500 r/min振荡萃取5 min，静置30 min分层后，使用巴斯德吸管将下层有机相转移至10 mL的样品瓶中，加入无水Na2SO4过夜后，氮吹浓缩至1 mL，贮存在-20 ℃条件下，等待进样。

1.3.2 GC-MS条件

气相色谱-质谱联用仪：气相色谱(GC 6890N)-质谱(MS 5975)；色谱柱：DB-FFAP毛细管色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm，安捷伦公司)。GC条件：氦载气，流速1 mL/min，初始柱箱温度50 ℃，维持2 min，6 ℃/min上升至230 ℃，维持15 min。进样口温度250 ℃，不分流模式，进样量1 μL。MS条件：溶剂延迟时间为8 min ，EI电离源，电离能量70 eV，离子源温度230 ℃，质谱扫描范围35～350 amu。分析过程采用选择离子监测(SIM)模式，选择离子为83、128、121、178。其中83、128和121、178分别作为葫芦巴内酯和内标的定性定量离子。

1.3.3 标准溶液的配制

用色谱纯乙醇及超纯水配制模拟黄酒基质溶液(含5.0 g/L乳酸，pH=4.5，酒精度为15% vol)备用。准确称取一定质量葫芦巴内酯标准品溶解于色谱级乙醇中配置成葫芦巴内酯母液(10 000 mg/L)。吸取一定体积葫芦巴内酯母液在模拟黄酒溶液中配置成一系列不同质量浓度的标准溶液。将标准溶液按照上述样品前处理方法处理后进行GC-MS分析，采用安捷伦工作站进行标准曲线的制作。

1.3.4 黄酒中葫芦巴内酯定性定量

定性：葫芦巴内酯的定性首先与NIST 08(Agilent Technologies Inc.)质谱库中标准谱图对比匹配、文献中葫芦巴内酯的保留指数比对进行初步鉴定，然后与葫芦巴内酯标准物质质谱图及保留指数比对并进行进一步定性。

定量：采用内标标准曲线法对葫芦巴内酯进行定量，将目标物与内标的质量浓度比值、峰面积比值分别作为横纵坐标进行标准曲线的制作。将样品中的目标物与内标的峰面积比值代入标准曲线进行黄酒样品中葫芦巴内酯质量浓度的计算。

1.3.5 方法学验证

回收率：通过标准曲线及样品分析可以明确葫芦巴内酯在黄酒中的含量，在黄酒样品中加入葫芦巴内酯标准品，并进行GC-MS分析。根据计算公式进行回收率R的验证:

式中:C0为加标前样品中的葫芦巴内酯质量浓度；C1为添加进样品中的葫芦巴内酯质量浓度；C2为加标后黄酒中葫芦巴内酯质量浓度。

精密度：对同一样品进行GC-MS分析，根据测得的含量进行精密度验证。当日精密度实验设计为同一天早中晚分别测定同一组样品3次，以其相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)表示；隔日精密度为连续3 d进样同一组样品，同样以RSD表示。以上过程重复3次。

1.3.6 黄酒中葫芦巴内酯阈值测定

根据文献报道的阈值测定的方法[17-18]，在模拟黄酒酒样(15%vol乙醇-水溶液，含5.0 g/L乳酸，pH=4.0)中添加葫芦巴内酯标准品，首先进行预实验，初步测定嗅觉感知的质量浓度范围，预计能闻到的大概质量浓度范围后，在这个质量浓度范围左右配制7种不同质量浓度葫芦巴内酯溶液。24位经过训练的品评员(22～26岁)参加阈值测定，从低质量浓度开始，逐一用三杯法，其中2杯是黄酒模拟酒样，另1杯是添加葫芦巴内酯的模拟黄酒(杯子以随机3位数进行编码)，品评员需在进行测试过程中记录下自己感知到的3杯黄酒中明显不同的一杯的序号。

2 结果与分析

2.1 萃取方法及萃取剂的选择

由于葫芦巴内酯极性较强且化学性质不稳定，萃取溶剂的选择对分析效果有决定性的影响。本研究比较了二氯甲烷、乙醚、戊烷对黄酒中葫芦巴内酯萃取效果的影响。采用20 mL酒样，分别加入5 mL的不同萃取剂，萃取后分离出萃取剂浓缩至1 mL后进行GC-MS分析，得到的谱图如图1所示，从该化合物的响应可看出3种溶剂萃取效果：二氯甲烷>乙醚>戊烷。通过对3种溶剂萃取的样本进行样品加标回收率的测试发现，二氯甲烷萃取后的样品回收率较高(>89%)。综合萃取效果及回收率等因素，最终选取二氯甲烷作为黄酒中葫芦巴内酯的萃取剂。

图1 不同溶剂对黄酒中葫芦巴内酯萃取效果的影响Fig.1 The effects of different solvents on the extraction of sotolon in Chinese rice wine

2.2 定量离子的选择

通过在样品中加入内标4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮萃取后进行全扫描(Scan)发现葫芦巴内酯的峰型不佳，且干扰离子较多，对准确定量影响较大。根据葫芦巴内酯和4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮的标准质谱图分析(图2)，发现葫芦巴内酯的特征离子中83和128相对其他特征离子来说干扰较小，因此选择其作为葫芦巴内酯的定量离子，而内标则选择121与178作为其定量离子，采用选择离子监测模式(SIM)进行定量分析。图3为SIM模式下的样品分析色谱图，图中截取了葫芦巴内酯及内标的色谱图，葫芦巴内酯与4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮的出峰时间分别在30.223 min和31.647 min左右。SIM模式相对全扫描模式来说针对性更强，更具选择性，峰型更好，能够较好的实现极微量目标物的检测。

图2 Scan模式下葫芦巴内酯及内标4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮的质谱图Fig.2 The mass spectrum of sotolon and 4-(4-methoxyphenyl)-2-butanone in full scan mode

图3 SIM模式下葫芦巴内酯及内标4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮的色谱图Fig.3 The chromatogram of sotolon and 4-(4-methoxyphenyl) -2-butanone in SIM mode

2.3 标准曲线及方法学参数的验证

2.3.1 标准曲线、相关系数、线性范围、检出限及定量限

在模拟黄酒中配制一系列质量浓度梯度的葫芦巴内酯标准溶液进行标准曲线的制作。通过安捷伦工作站分析获得黄酒中葫芦巴内酯定量标准曲线，具体方法学参数见表1。结果显示葫芦巴内酯标准曲线的线性良好，R2=0.994。以信噪比(S/N)为3的质量浓度0.66 μg/L作为方法的检出限，以信噪比(S/N)为10的质量浓度1.02 μg/L作为方法的定量限，其定量限及检测限都远远低于该化合物在黄酒中的含量，也低于前期基于SPE-LVI-GC-MS方法的定量限。

表1 基于液液微萃取-气相色谱-质谱联用技术定量黄酒中葫芦巴内酯的方法学参数Table 1 Quantitative determination of sotolon in Chinese rice wine based on liquid-liquid microextraction-gas chromatography-mass spectrometry

2.3.2 回收率及精密度

将葫芦巴内酯标准品加到4个实际样品中，每个样品重复测定3次，计算其回收率及相对标准偏差(表2)，结果显示所有样品中测定的回收率均在80%～120%之间，且RSD在10%以内。当日精密度及隔日精密度的RSD均在10%以内，说明该方法满足黄酒中微量物质的定量要求。

表2 不同样品中葫芦巴内酯加标回收率及精密度(n=3)Table 2 The recovery rate and precision of sotolon in different rice wine samples (n=3)

2.4 不同地区黄酒中葫芦巴内酯的分布规律

采用本研究建立的LLME-GC-MS方法对我国不同地区的24个黄酒样品中葫芦巴内酯含量进行了定量分析。结果显示在所有分析的黄酒样品中均能检测到葫芦巴内酯的存在，说明该化合物在黄酒中普遍存在。表3列出了不同地区黄酒中葫芦巴内酯含量分布情况，结果显示本研究分析的市售黄酒中葫芦巴内酯含量在42.05～244.34 μg/L之间，且不同地区黄酒中葫芦巴内酯含量差异明显。浙江与上海地区的黄酒中葫芦巴内酯含量均在100 μg/L以上，最高含量达到244.34 μg/L(Z-6)。但是其他地区(含量在52.49～79.18 μg/L)及江苏地区(含量在42.05～81.05 μg/L)的黄酒中葫芦巴内酯含量则是明显低于浙江和上海地区的黄酒。从图4的箱型图可直观看出各地区黄酒中葫芦巴内酯含量分布情况，图中结果显示浙江及上海地区的黄酒中葫芦巴内酯含量明显高于其余两个地区的黄酒。此外，通过单因素方差分析对4个地区黄酒中葫芦巴内酯含量进行了差异性比较，结果显示浙江地区黄酒中葫芦巴内酯与江苏及其他地区黄酒中葫芦巴内酯含量均存在显著性差异(p<0.001)，而上海地区黄酒与江苏及其他地区黄酒中葫芦巴内酯含量也存在显著性差异(p<0.05)，这说明葫芦巴内酯可能是区分不同区域黄酒风味差异的关键香气物质之一。

表3 不同地区黄酒中葫芦巴内酯含量及OAVTable 3 The concentration and OAV of sotolon in Chinese rice wine in different regions

注：平均质量浓度为3次平行实验的平均质量浓度；SD为相对标准偏差。

为了进一步研究葫芦巴内酯对黄酒的风味贡献，采用文献中报道的方法首次测定了黄酒中葫芦巴内酯的香气阈值，黄酒中葫芦巴内酯在黄酒基质中的香气阈值为11 μg/L，是黄酒中典型的“量微香大”的香气化合物。

香气活力值(odor activity value，OAV)表示香气化合物质量浓度与阈值的比值，是目前研究香气化合物香气贡献的有效方法。当化合物在酒中含量超过其阈值，即OAV≥1，说明该物质对酒的整体香气是有贡献的[19]。通过测定的黄酒中葫芦巴内酯的香气阈值及市售酒中葫芦巴内酯含量进行OAV的计算，从表3可明显看出葫芦巴内酯在所有黄酒中的OAV均大于4，其中，江苏地区及其他地区黄酒中OAV在4～7之间，浙江及上海地区的黄酒中OAV大于等于10，说明该化合物对黄酒香气具有重要贡献。从图4的箱型图同样可直观地看出所有黄酒中葫芦巴内酯质量浓度均在阈值(11 μg/L)之上，其对黄酒的整体香气有极大的贡献。

图4 不同区域黄酒中葫芦巴内酯含量分布Fig.4 The concentration of sotolon in Chinese rice wine from different Regions

3 结论

本研究基于液液微萃取结合GC-MS技术建立了黄酒中“焦糖香”特征香气物质葫芦巴内酯含量的检测方法。该方法检测限低至1.02 μg/L，测定准确性和精密度良好。该方法具有样品用量少，简单快速的特点，能够满足黄酒中关键香气葫芦巴内酯批量快速检测的需要。采用该方法分析了不同地域24款典型黄酒样品中葫芦巴内酯的含量，结果显示该物质在黄酒中普遍存在，且含量在42.05～244.34 μg/L之间。首次测定了黄酒基质中葫芦巴内酯的香气阈值(11 μg/L)，并基于OAV研究了葫芦巴内酯在黄酒中的风味作用，结果显示所有测定样品中葫芦巴内酯含量均高于其香气阈值，表明该物质对黄酒整体香气具有重要影响。进一步比较分析发现葫芦巴内酯在浙江和上海地区黄酒中含量显著高于其余地区黄酒，表明葫芦巴内酯可能是一个能区分不同区域黄酒的潜在标志性化合物。