细菌内毒素检查法在纳米银医用抗菌敷料评价中的应用

罗洋 袁博 天津市医疗器械质量监督检验中心 （天津 300384）

内容提要： 依据《中华人民共和国药典》（2015年版）四部1143细菌内毒素检查法和“YY/T 1295-2015医疗器械生物学评价-纳米材料：细菌内毒素试验”，研究浸提时间对试验结果的影响，同时比对凝胶限度试验、凝胶半定量试验和动态浊度法在该产品细菌内毒素检测结果的一致性。以探讨纳米银抗菌敷料的细菌内毒素定性与定量检查方法。结果表明，该产品在37˚C下浸提1～2h细菌内毒素含量不发生明显改变；该产品在三种试验条件研究下的结果具有一致性，其内毒素限值符合规定。

纳米银颗粒由于直径极其微小、比表面积极大和极易进入病原体等特点在抗菌医用导管、抗菌敷料、牙科材料和植入材料等方面具有广阔的应用前景[1,2]。目前国内已经批准上市的纳米银产品多为抗菌敷料和妇用凝胶，纳米银抗菌敷料具有良好的抗感染作用，毒副作用小且纳米银含量不会产生积累现象[3,4]。

细菌内毒素试验是利用鲎试剂和细菌内毒素产生凝集反应来判断医疗器械中细菌内毒素限量是否符合规定，是目前国际上通用的最简便有效的方法，具有重现性强，灵敏度高等优点。本文依据《中华人民共和国药典》（2015年版）四部[5]1143细菌内毒素检查法和《YY/T 1295-2015医疗器械生物学评价 纳米材料：细菌内毒素试验》[6]，利用凝胶限度试验、凝胶半定量试验和动态浊度法三种试验方法比较不同浸提时间对纳米银医用抗菌敷料的细菌内毒素含量的影响，同时从定性、半定量和定量各个维度考察该产品细菌内毒素含量，为评价临床应用纳米银抗菌敷料的安全性提供参考。

1.材料与设备

1.1 材料与试剂

试验材料：纳米银医用抗菌敷料（规格：10cm×15cm，批号：170103，公司：深圳市爱杰特医药科技有限公司）。

试剂：①细菌内毒素工作标准品（效价：10EU/mL，批号：1603300，公司：湛江安度斯生物有限公司）；②鲎试剂（灵敏度：0.25EU/mL，批号：1701091；灵敏度：0.015EU/mL，批号：1703100，公司：湛江安度斯生物有限公司）；③动态浊度法鲎试剂（规格：1.25mL/支，批号：1504230，检测范围：10～0.005EU/mL，公司：湛江安度斯生物有限公司）；④细菌内毒素检查用水（规格：50mL/瓶，批号：1605180，内毒素含量：低于0.003EU/mL，公司：湛江安度斯生物有限公司）。

1.2 设备

①ET-96内毒素凝胶法测定仪（公司：天津天大天发科技有限公司）；②细菌内毒素检查-32M细菌内毒素检测仪（公司：天津天大天发科技有限公司）。

2.方法与结果

2.1 样品溶液的制备

取300cm2敷料，吸饱和后加入50mL细菌内毒素检查水浸没样品置（37±1）˚C浸提1h。同法，制备浸提时间为2h的样品溶液。

2.2 凝胶法

2.2.1 鲎试剂灵敏度复核

按《中华人民共和国药典》（2015年版）四部[5]1143细菌内毒素检查法复核鲎试剂灵敏度。本次试验所用的2批鲎试剂灵敏度分别为0.25EU/mL和0.015EU/mL。结果显示，2批鲎试剂灵敏度的测定值分别为0.25EU/mL和0.015EU/mL，均符合规定，可用于试验。

2.2.2 干扰预实验

有文献表明，该类产品的细菌内毒素限值为0.5EU/mL，目前市售鲎试剂的最高灵敏度为0.015EU/mL，因此该样品溶液最大有效稀释倍数MVD为33倍[7]。将样品溶液用细菌内毒素检查水进行一系列倍比稀释，最大稀释倍数不超过MVD。每一稀释倍数下制成含细菌内毒素标准品2λ浓度的样品溶液阳性对照，用标示灵敏度为0.25EU/mL的鲎试剂进行试验。同时，设置阳性和阴性对照。结果表明（表1），浸提1h和2h的样品溶液在2倍稀释后有可能排除干扰。

2.2.3 干扰试验

按《中华人民共和国药典》（2015年版）四部[5]1143细菌内毒素检查法进行干扰试验。用细菌内毒素检查水及样品溶液2倍稀释液将内毒素工作标准品稀释成所需浓度，选用标示灵敏度为0.25EU/mL的鲎试剂进行试验[5]。结果表明，2λ/样品溶液的结果均在0.5～2λ，说明样品溶液2倍稀释液对细菌内毒素试验无干扰作用。见表2。

2.2.4 凝胶限度试验

取样品溶液2倍稀释液为供试液，用灵敏度为0.25EU/mL的鲎试剂进行细菌内毒素检查。结果表明，该产品的细菌内毒素检查符合规定，即样品中的细菌内毒素含量小于0.5EU/mL。见表3。

2.2.5 凝胶半定量试验

用细菌内毒素检查水将样品溶液2倍稀释液稀释2、4、8倍，最大稀释倍数不超过MVD。使用灵敏度为0.015EU/mL的鲎试剂检测样品溶液中的内毒素含量。见表4。供试品系列的反应终点浓度均为0.24EU/mL，终点浓度乘以初始稀释倍数2，得到1h样品溶液和2h样品溶液的内毒素浓度均为0.48EU/mL，低于规定的限值0.5 EU/mL。

2.3 动态浊度法

2.3.1 标准曲线的可靠性试验

用细菌内毒素检查水将内毒素工作标准品制成浓度分别为5EU/mL、1EU/mL、0.2EU/mL和0.04EU/mL的稀释液，各取0.2mL加入预先加入0.1mL动态浊度法鲎试剂的玻璃管内，混合均匀后插入仪器内进行检测，每一浓度做3支平行管，同时用细菌内毒素检查水做2支阴性对照。见表5。阴性对照的反应时间大于标准曲线最低点的反应时间，回归方程为LgT=2.82283+(-0.22808LgC)，其中相关系数r=-0.9977，故标准曲线成立。

表1. 干扰预试验结果

表2. 干扰试验结果

表3. 凝胶限度试验结果

表4. 凝胶半定量试验结果

表5. 标准曲线可靠性试验结果(n=3)

2.3.2 干扰试验

将制备好的1h样品溶液和2h样品溶液各稀释8倍，并分别在稀释液里加入λm为0.5EU/mL的内毒素标准溶液。各取上述4种溶液0.2mL分别加入预先加入0.1mL动态浊度法鲎试剂的玻璃管内，每种溶液做2支平行管。标准曲线的制备同2.3.1，每一浓度做2支平行管。同时用细菌内毒素检查水做2支阴性对照。结果显示，标准曲线的回归方程为LgT=2.73639+(-0.5965LgC)，其中相关系数r=-0.9991，1h供试品溶液8倍稀释液的回收率为148%，2h供试品溶液8倍稀释液的回收率为123%，因此认为1h供试品溶液8倍稀释液和2h供试品溶液8倍稀释液在本试验条件下均不存在干扰作用。

2.3.3 样品溶液内毒素含量测定

1h供试品溶液8倍稀释液和2h供试品溶液8倍稀释液的内毒素实测值分别为0.0583EU/mL和0.0558EU/mL。乘以稀释倍数8后，1h样品原液和2h样品原液的细菌内毒素含量分别为0.4664EU/mL和0.4464EU/mL，均小于0.5EU/mL的限值。

3.讨论

YY/T 1295-2015[6]制备供试品溶液的浸提时间未定，而一般情况下医疗器械浸提时间为不少于1h[8]。而查阅文献发现，医用敷料细菌内毒素试验中的浸提时间均为2h[7-9]。本文对纳米银抗菌敷料分别浸提1mL和2h后的样品溶液进行了定性到定量的一系列试验，结果发现，浸提时间为1h或2h对检测结果均无影响，该产品的细菌内毒素含量不发生明显改变。查阅文献还发现，制备样品溶液时浸提比例有3cm2/mL、4cm2/mL和6cm2/mL，YY/T 1295-2015[6]中规定供试品浓度在必要时选择体外细胞试验中确定的最高浓度，因此，本次试验的浸提比例选择更为严格的6cm2/mL[7-9]。试验结果显示，按此比例得到的浸提液内毒素浓度小于0.5EU/mL。

细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法，凝胶法又分凝胶限度试验和凝胶半定量试验。光度测定法比较常用的是动态浊度法。本文利用凝胶法考察纳米银抗菌敷料的细菌内毒素含量时，首先进行干扰试验预试验推测排除干扰的稀释倍数，再通过正式干扰试进一步确认样品原液稀释2倍后即可消除干扰。干扰试验结果说明凝胶法对于纳米银抗菌敷料的细菌内毒素检查是可行的。凝胶限度试验和半定量试验结果显示该产品细菌内毒素含量均小于0.5EU/mL。利用动态浊度法考察纳米银抗菌敷料的细菌内毒素含量时首先也是进行干扰试验，样品原液稀释8倍后其内毒素回收率在50%～200%范围内，表明样品原液的8倍稀释液不存在干扰作用，可以用动态浊度法定量检测纳米银抗菌敷料的细菌内毒素含量，检测结果显示该产品的内毒素含量同样符合规定。综上结果发现纳米银抗菌敷料利用凝胶限度试验、凝胶半定量试验和动态浊度法测得细菌内毒素含量的结果具有高度一致性。

细菌内毒素试验作为纳米材料生物学评价体外试验的重要指标，对于评价纳米材料的生物安全非常重要。本文通过供试品的稀释成功地克服了干扰，从凝胶法和动态浊度法两个方面较深入全面的评价了纳米银敷料细菌内毒素的情况，为纳米银产品建立高质量的检测和评价方法提供了依据。