4株狂犬病毒感染小鼠的临床症状及脑组织病理学观察

徐素萍　黄小芳　刘宇明　苏荷　李晓宁　罗廷荣

摘要：[目的]对比狂犬病毒固定强毒株CVS-24、广西街毒株GX074、弱毒株rRC-HL和重组毒株rRC-HLAG感染小鼠后的临床症状及脑组织病理学变化，为揭示狂犬病毒的致病机理提供参考依据。[方法]将CVS-24、GX074、rRC-HL和rRC-HLAG分别通过脑内注射SPF级昆明小鼠，以注射DMEM为对照，每只小鼠注射30μL，攻毒后连续观察测量小鼠的体重和死亡情况，采取濒临死亡小鼠的脑组织制作石蜡切片，经HE染色后观察脑组织的病理变化。[结果]与DMEM组的小鼠相比，rRC-HL组小鼠攻毒后的体重先下降后恢复正常，而其他攻毒组小鼠的体重迅速下降直至死亡。DMEM组和rRC-HE组的小鼠在整个试验周期内未见死亡；CVS-24组、GX074组和rRC-HL△G组的小鼠在攻毒后全部发病死亡，其中，CVS-24组小鼠出现死亡的时间最早（攻毒后第5 d），且在攻毒后第6 d全部死亡。通过观察小鼠脑组织的病理学变化，发现rRC-HL组小鼠脑组织的炎症反应最严重，其神经纤维紊乱，神经元细胞变形，细胞边缘不清晰，少量细胞固缩甚至消失，海马回神经胶质细胞浸润，嗜神经现象明显，血管套现象严重；rRC-HLAG组次之；GX074组和CVS-24组小鼠的脑组织病变轻微，可见少量嗜神经现象。[结论]rRC-HL△G、Gx074和CVS-24等3株狂犬病毒强毒株的临床症状更明显，发病死亡率达100%，但与弱毒株相比，其炎症反应较轻微，说明狂犬病毒强毒株可能是通过抑制机体脑组织中促炎因子的产生而抑制炎症反应出现，阻断其固有免疫反应，不利于机体对病毒的清除。

关键词：狂犬病毒；小鼠；感染；临床症状；脑组织；病理变化

中图分类号：$852.659.5 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）03-0586-06

0引言

[研究意义]狂犬病是一种致死性嗜神经性疾病，可感染包括人类在内的几乎所有哺乳动物。狂犬病呈世界性分布，广泛威胁人畜健康，在发展中国家尤其严重。截至2012年，全球仍然有90多个国家或地区发生狂犬病（陈奇，2013）。近10年来，我国累计狂犬病致死人数约22240人，广西是狂犬病高发地区，仅2004年的狂犬病死亡人数就达601人（熊毅等，2008）。可见，狂犬病已成为严重的公共卫生问题。目前尚无针对狂犬病的治疗特效药物，只能通过预防控制其发生，而疫苗接种是最有效的防控措施（陈奇，2013）。因此，研究狂犬病毒不同毒株的致病性及其病理变化，可为阐明其致病机理和研发新型疫苗提供参考依据。[前人研究进展]至今，国内外已有关于狂犬病毒不同毒株致病性及其病理变化差异的研究报道。Etessami等（2000）研究发现，缺失G基因的狂犬病毒不能经突触传播。Yan等（2002）研究发现，将表达CVS-N2C或CVS-B2C糖蛋白的SN-10重组病毒株（RN2C和RB2C）接种到大鼠海马后，病毒主要分布在海马和大脑皮层；当SN-10重组病毒株表达水疱性口炎病毒的G蛋白时，重组病毒SN-10-VG在海马的分布显著增多，说明狂犬病毒G蛋白与病毒在脑内的分布有关。Phares等（2006）通过鼻内接种狂犬病毒弱毒株，发现弱毒株可被小鼠小脑细胞清除，是由于感染狂犬病毒弱毒株后机体血脑屏障通透性增强，病毒中和抗体通过血脑屏障进入脑内而对病毒起清除作用。Kuang等（2009）研究发现，狂犬病毒弱毒株通过诱导趋化因子而增强血脑屏障的通透性，有利于炎症细胞侵润中枢神经系统。Ito等（2010）研究表明，狂犬病毒弱毒株rRC-HL在小鼠脑内的传播效率低于致病性毒株R（G 242/255/268），且病毒在小鼠神经细胞中表现出明显不同的分布状态。Gomme等（2012）通过对比同一来源的感染和未感染狂犬病毒的小鼠脑细胞，结果发现感染狂犬病毒后幸存神经元细胞的神经突生长能力和微管动力学有所下降，即使在清除病毒后也无法恢复其原有功能，说明狂犬病毒能引起永久性的神经损伤。近年来，本课题组从广西健康犬分离获得1株狂犬病毒街毒株GX074，该毒株对成年小鼠具有很强的致病性，在NA、BHK和Raw264.7细胞中能抑制IFN-α/β产生，但经肌肉或脑内接种小鼠至病重时会引起脑内高水平的IFN-α/β产生（蒋元，2017）。为验证GX074的致病性，本课题组又以日本疫苗株RC-HL为骨架，利用反向遗传技术替换GX074的G蛋白，构建了多个突变体。[本研究切入点]狂犬病毒G蛋白介导病毒与宿主细胞的结合，影响其在神经系统中的分布，与病毒的毒力、致病性密切相关（周松峰等，2011；王攀等，2017）。G蛋白的微小变化哪怕是一个氨基酸的改变均有可能影响病毒的毒力，Sato等（2015）研究证实狂犬病毒缺失G基因后其转录水平升高，但免疫原性下降，且G蛋白具有細胞毒性作用。但至今鲜见从临床症状及组织病理学变化角度揭示狂犬病毒G蛋白与其致病性关联的研究报道。[拟解决的关键问题]以狂犬病毒弱毒株rRC-HL为骨架替换广西街毒株GX074的G基因，构建rRC-HL△G重组株，对比CVS-24（固定强毒株）、GX074、rRC-HL和rRC-HL△G感染小鼠后的临床症状及脑组织病理学变化，为揭示狂犬病毒的致病机理提供参考依据。

1材料与方法

1.1试验材料

CVS-24由亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室保存提供；GX074分离自广西百色市德保县市场屠宰犬的脑组织；rRC-HL△G由本课题组应用反向遗传学技术拯救获得；RC-HL是目前日本广泛应用的疫苗株，由西原株（Nishigahara，Ni）经细胞传代后获得的固定毒株。4周龄SPF级昆明小鼠购自广西医科大学动物实验中心，体重约20 g/只。硫酸铝钾、苏木色精、伊红、氧化汞、石蜡、5%冰乙酸、冰醋酸、4%多聚甲醛（PFA）、乙醇、二甲苯、1%盐酸酒精、环保脱蜡剂、中性树胶等均在使用有效期内。主要仪器设备有组织石蜡包埋机、轮转式组织切片机和Nicon ECLIPSE Ti光学显微镜等。

1.2动物接种试验

将CVS-24、GX074、rRC-HL和rRC-HL△G用病毒稀释液稀释至1000 FFU/30 μL，脑内注射SPF级昆明小鼠，每只小鼠注射30 gL，同时以注射DMEM为对照。每组15只小鼠，攻毒后连续观察15 d。在攻毒后小鼠濒临死亡时剖解采集脑组织，对照组和rRC-HL组于攻毒后第7 d采集5只小鼠的脑组织，剩余小鼠每天观察体重变化和l临床症状。

1.3石蜡切片制作

采集的小鼠脑组织用4%PFA固定24 h，流水冲洗4 h，然后进行梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋和切片，石蜡切片经烤片后置于4℃冰箱保存备用（时小艳和潘丽红，2014）。

1.4HE染色

石蜡切片放入60℃烤箱中复温10 min，然后进行脱蜡，苏木精染色10 min，流水冲洗后用1%盐酸酒精分化1-2 s，流水返蓝15 min。经梯度酒精脱水，伊红复染，中性树胶封片，Nicon ECLIPSE Ti光学显微镜观察染色结果，并用NIS-Elements AR 3.2进行图像采集和分析。

2结果与分析

2.1临床症状观察结果

CVS-24组小鼠在攻毒后第4 d出现毛乱、弓背、蜷缩、极度兴奋等症状，且发病后死亡。GX074组小鼠在攻毒后第6 d开始出现临床症状，体重下降，之后发病症状不断加重，表现为狂躁不安，异常兴奋，不停跳动；一般病程较短，发病后24 h内死亡。rRC-HL组小鼠在攻毒后第4 d开始出现临床症状，体重下降，精神沉郁，食欲不振，皮毛杂乱，病症持续至攻毒后第8 d，至第9d小鼠恢复正常。rRC-HLAG组小鼠在攻毒后第6 d开始发病，食欲不振，身体消瘦，体重下降，皮毛杂乱，呆立不动，对刺激敏感，至攻毒后第8-9 d全身震颤，后驱瘫痪，体温下降，呼吸衰竭，濒临死亡。各处理组小鼠的临床症状详见表1。

2.2接种病毒后小鼠的体重变化趋势

由图1可看出，整个试验期间DMEM组小鼠的体重持续上升，而CVS-24组、rRC-HL组和rRC-HL A G组小鼠的体重在攻毒后第3 d开始下降，以CVS-24组小鼠体重的降幅最明显，rRC-HL组小鼠在攻毒后第8 d其体重逐渐恢复正常。GX074组小鼠的体重在攻毒后第4 d才开始下降，但此处理组小鼠一旦发病即迅速死亡。

2.3接种病毒后小鼠的死亡情况

由图2可看出，DMEM组和rRC-HL组的小鼠在整个试验周期内未见死亡。CVS-24组、GX074组和rRC-HLAG组的小鼠在攻毒后全部发病死亡，其中，CVS-24组小鼠出现死亡的时间最早（攻毒后第5 d），且在攻毒后第6 d全部死亡；GX074组和rRC-HL A G组小鼠分别在攻毒后第6和7 d开始出现死亡，至攻毒后第10 d也全部死亡。

2.4接种病毒后小鼠脑组织的病理学变化

镜检发现，狂犬病毒可引起小鼠非化脓性脑炎，且呈弥漫性炎症，有大量的血管周围淋巴细胞管套（图3-A）、神经元坏死、嗜神经现象（图3vB）和胶质细胞增生（图3-C），其病理变化多见于灰质区，特别是脑干、海马、小脑和脊髓，可见神经元被胶质细胞替代而构成小的神经结节（图3-D）。在DMEM组小鼠的脑组织切片未观察到任何病变，其海马区神经元细胞结构完整，边缘清晰，胞核胞浆分界清楚（图3-E）；神经胶质细胞分布均匀，少量围绕在血管周围（图4-A）。rRC-HL组小鼠的脑组织神经纤维紊乱，神经元细胞变形，细胞边缘不清晰，少量细胞固缩甚至消失；海马回神经胶质细胞浸润，嗜神经现象明显，血管套现象严重（图4-B）。CVS-24组和GX074组小鼠的脑组织病变较轻微，可见少量嗜神经现象（图4-C和图4-D）。rRC-HL△G组小鼠的海马回胶质细胞增生，嗜神经现象较明显（图4-E）。

3讨论

本研究发现，CVS-24组小鼠出现死亡的时间最早，于攻毒后第4 d开始出现毛乱、弓背、蜷缩等临床症状，第6 d全部死亡；但其脑组织病理变化不明显，可能是由于CVS-24是固定强毒株，能逃避宿主的固有免疫和抗病毒应答（Wang et a1.，2005），因此炎症反应不明显。rRC-HL（弱毒株）感染小鼠后发病较早、病程长，但临床症状较轻微，后期体重恢复正常，小鼠可耐过；其脑组织切片可见大量胶质细胞增生，血管套现象严重，嗜神经现象较多。GX074是广西街毒株，感染小鼠后第6 d才开始发病，与弱毒株rRC-HL相比，其发病时间延后，但病程短，死亡前几小时异常兴奋狂躁，死亡率达100%；脑组织病理切片观察发现胶质细胞增生不如rRC-HL组小鼠的明显，可能是由于小鼠快速死亡，尚未及时产生胶质细胞，也未形成典型的炎症反应（聂盼等，2011），故病毒性脑炎症状不明显。由于脑组织内缺乏淋巴系统，胶质细胞作为其特有的免疫细胞，主要参与修复、吞噬、免疫和炎症反应（孙红宇和张卉，2001）。大量增生的胶质细胞可能在清除变性坏死神经组织碎片的过程中发挥作用（郝玲等，2011）；此外，胶质细胞激活后会释放细胞因子和细胞毒性物质，触发免疫应答、激活多种蛋白酶而发挥杀伤性作用（王大力等，2012）。

G基因被认为是决定狂犬病毒致病性的主要基因（Ito et a1.，2001），其他病毒蛋白基因则对狂犬病毒的致病性和毒力起协同作用。狂犬病毒G蛋白介导病毒与宿主细胞的结合，并影响狂犬病毒在神经系统中的分布（周松峰等，2011；王攀等，2017）。本课题组的前期研究将GX074的G基因替换到rRC-HL后拯救获得rRC-HL△G，该重组病毒株能感染小鼠發病死亡，与rRC-HL相比，小鼠的临床症状更严重，出现全身震颤，后驱瘫痪，呼吸衰竭，进一步证明狂犬病毒的致死性与G蛋白密切相关；脑组织病理变化较rRC-HL感染的轻微，则表明狂犬病毒的毒力与G蛋白相关。rRC-HL△G能100%致死小鼠，脑组织的病理变化相对于GX074感染更严重，并引起小鼠固有免疫和抗病毒应答，可能与狂犬病毒的其他基因有关。虽然目前已有研究报道，狂犬病毒强毒株和弱毒株在宿主体内引起不同的免疫应答，但不同毒株感染引起的脑组织病理学变化鲜见报道。本研究通过对比rRC—HL△G、rRC-HL、GX074和CVS-24感染小鼠后的临床症状及脑组织病理学变化，结果发现，rRC-HL△G、GX074和CVS-24等3株强毒株的临床症状更明显，发病死亡率达100%，但与弱毒株相比，其炎症反应较轻微，说明狂犬病毒强毒株可能是通过抑制机体脑组织中促炎因子的产生而抑制炎症反应出现，阻断其固有免疫反应，不利于机体对病毒的清除。该结论对深入研究狂犬病毒的致病机理及制订科学有效的防控措施具有重要参考价值。

4结论

rRC-HL△G、GX074和CVS-24等3株狂犬病毒强毒株的临床症状更明显，发病死亡率达100%，但与弱毒株相比，其炎症反应较轻微，说明狂犬病毒强毒株可能是通过抑制机体脑组织中促炎因子的产生而抑制炎症反应出现，阻断其固有免疫反应，不利于机体对病毒的清除。

（责任编辑 兰宗宝）