蚕丝蛋白用作胶囊壳材料的研究

刘凯 匡大江 王诗怡 付华 王垠龙 卢神州

摘要： 当前，市场上胶囊的主要制作原料是明胶，由于明胶胶囊价格昂贵，并且具有低溶解性所导致的药效不能有效发挥的缺点，因此寻找替代材料刻不容缓。文章采用蚕丝蛋白来替代明胶，研究不同配比丝素丝胶制备的胶囊壳复合材料的结构特性。通过加入脯氨酸、甲酰胺、乙二醇来调节材料在模拟胃液、肠液中的崩解时间，测定细胞培养检测材料的细胞相容性等。结果表明，随着丝胶含量的提高，复合材料容易在胃液中崩解，而随着丝素含量提高，材料不易在胃液浸泡下崩解，但可以在肠液中崩解。利用结构调节剂可以期望获得某些用于胃、肠胶囊壳的新型材料。

关键词： 丝素;丝胶;胶囊;崩解;细胞相容性

Study on silk protein used as capsule shell material

LIU Kai KUANG Dajiang WANG Shiyi FU Hua WANG Yinlong LU Shenzhou

（a.College of Textile and Clothing Engineering; b. National Engineering Laboratory for Modern Silk， Soochow University， Suzhou 215123， China）

Abstract： At present， the main raw material for capsule production on the market is gelatin. Since gelatin capsules are expensive and have the disadvantage of low solubility which causes that the drug effect cannot be effectively exerted. Thus， it is imperative to find alternative materials. In this paper， silk fibroin （SF） was used as a substitute for gelatin， and structural properties of capsule shell composites prepared with different ratio of silk fibroin and sericin were studied. The disintegration time of the material in the simulated gastric juice and intestinal fluid was adjusted by adding proline， formamide， and ethylene glycol， and the cell compatibility of the material was detected by cell culture. The results showed that with the increase of sericin content， the material was easy to disintegrate in gastric juice. With the increase of silk fibroin content， the material was not easy to disintegrate in gastric juice immersion， but disintegrated in intestinal juice. Some new materials for the production of gastro intestinal capsule shells can be expected to be obtained by using structural regulators.

Key words： silk fibroin; sericin; capsule; disintegration; cytocompatibility

明膠空心胶囊是由明胶加辅料制成的空心硬胶囊，胶囊能够有效地掩盖内容物令人不舒服的味道和气味，易于吞服，真正实现了良药不再苦口。市场上明胶价格昂贵，导致一些不良商家使用鞣制过的皮革代替明胶生产出“毒胶囊”，造成胶囊重金属严重超标。因此，寻找新型材料来替代明胶胶囊已经成为未来发展方向[1]。目前已有以玉米淀粉等为主要原料制备的胃溶型空心胶囊，但淀粉的增加会导致膜的强度降低，需要添加增强剂来弥补[2 3]。有采用明胶和羟丙甲纤维素制备的肠溶型空心胶囊，需要在胶囊壳外层包裹一层肠溶衣，采用戊二醛对明胶进行交联，可能造成醛超标[4 5]。如何来保证胶囊膜片在干湿态下具有较好的机械性能，如何解决胶囊的制备、存储、药物释放，以及生物相容性、崩解等问题，是目前需要研究的重点。市场上出现了以海藻酸钠、淀粉为主要原料制备的植物性肠溶胶囊[6]，但此类胶囊在湿态条件下的机械性能很快降低，胶囊进入人体后可能提前破裂，而采用醛类交联反应可能产生一定的毒性[7]。在大部分替代或者明胶改性胶囊的研究中，缺少材料的细胞相容性测定实验，很难保证经过改性后材料的生物相容性问题，所以研究一种新的肠、胃胶囊壳材料至关重要。

丝胶蛋白具有良好的亲水性，结构与胶原相似而来源于鳞翅目昆虫，不会携带对哺乳类人体有害的病毒，而且价格便宜，因此是一种良好的明胶替代材料。但是，纯丝胶溶液制备的材料容易断裂，韧性不足[8 9]。丝素蛋白无毒无害，具有良好的机械性能和生物相容性。因此，本研究考虑采用丝素/丝胶蛋白混合材料来制备胃、肠胶囊壳可能是一种可行的选择。

为了改善丝素丝胶易溶于水的特性，可以通过加入小分子结构调节剂来控制其溶失率。本研究选取甲酰胺、乙二醇、脯氨酸这三种结构调节剂，其中甲酰胺具有醛基，将生成化学交联[10];乙二醇则形成silk Ⅱ结晶结构[11]，大大延缓丝素蛋白的降解;脯氨酸则促使丝素蛋白形成silk I结晶结构[12]，促使丝素蛋白形成水不溶性材料。通过调节丝胶蛋白与丝素蛋白的不同比例，进一步调控其在胃液和肠液中的崩解时间，用于制备具有生物相容性良好的复合材料作为替代胃、肠胶囊壳的新材料。

1 材料与方法

1.1 溶液的制备

1.1.1 丝素溶液的制备

家蚕丝用0.05%的Na2CO3脱胶三次、烘干，用9mol/L LiBr溶液溶解，然后透析3d，过滤得到纯丝素溶液[13]。采用重量法测定其质量浓度为35mg/mL。

1.1.2 丝胶溶液的制备

家蚕茧去除蛹后，茧壳按1︰10的浴比加入去离子水，放入120℃灭菌锅中高温脱胶30min，取上层溶液得到丝胶溶液[14]。重量法测定其质量浓度为10mg/mL。

1.2 胶囊用共混膜的制备

配置100mg/mL的甲酰胺、乙二醇和脯氨酸水溶液。控制丝胶/丝素/乙二醇（脯氨酸）的质量比为0︰100︰30、20︰80︰30、50︰50︰30、80︰20︰30、100︰0︰30，丝胶/丝素/甲酰胺的质量比为0︰100︰10、20︰80︰10、50︰50︰10、80︰20︰10、100︰0︰10混合，注入到直径90mm2培养皿内，真空消除气泡后，75℃烘箱干燥0.5h（模拟胶囊制备过程中的快速干燥过程），然后置于恒温恒湿间（温度25℃，湿度65%），干燥成膜（模拟胶囊成型过程后的放置过程）。

1.3 胶囊用共混膜溶失率的测定

共混膜在恒温恒湿（温度25℃，湿度65%）环境下平衡24h，称重后于105℃烘箱烘至恒重，计算含水率（ω）。不同比例的共混膜，测定质量M1，置于37℃水浴恒温震荡器内震荡24h。离心取上清液，在紫外分光光度计上测量在278nm波长上的吸光度A值，换算成丝素蛋白浓度，计算获得共混膜中的蛋白溶失率（D）。离心后的下层固体用去离子水洗净，离心弃去上清液，重复以上操作三次，下层固体105℃烘箱中烘至恒重为M2，计算得质量损失率（W）。

蛋白溶失率和质量损失率按下式计算：

D/%=KAV（M1-M1×ω）×100（1）

式中：K为蛋白溶液的紫外吸光常数，K=1.1012;A为吸光度;V为溶液的总体积。

1.4 仪器与设备

DF 101S集热式磁力搅拌器（河南巩义予华仪器有限公司），DHG 9246A型电热恒温鼓风干燥机箱（上海精宏实验设备有限公司），全自动XPERT PRO MPD射线衍射（荷兰PANlytical Company），电子天平、双哈牌YX280型手提式不锈钢压力蒸汽灭菌锅（上海三申医疗器械有限公司），TMS PRO型质构仪（美国Food technology Corporation），二氧化碳细胞培养箱（Thermo Fisher Scientific公司），TH4 200型OLYMPUS荧光倒置显微镜（Olympus Corproration Tokyo Japan），低速离心机（DNO412型赛洛捷克），MoxiTMZ细胞计数仪（美国ORFLO Technoloies公司），35mm共聚焦专用皿（韩国SPL公司）。

1.5 胶囊用共混膜的力学性能测试条件

干态力学性能测试：共混膜先在恒温恒湿间（温度25℃，湿度65%）平衡24h，用A型哑铃刀压制出拉伸性能样品，螺旋测微仪测出样品的厚度H，在Instron 3365万能试验机上测定拉伸断裂强力，计算拉伸断裂强度、拉伸断裂伸长率，夹距为28mm，拉伸速度为20mm/min。

湿态力学性能测试：共混膜用A型哑铃刀压制出拉伸性能样品，螺旋测微仪测出样品的厚度H后，在0.9%氯化钠溶液浸泡24h，取出后吸去表面的水分，Instron 3365万能试验机上测定拉伸断裂强力，计算拉伸断裂强度、拉伸断裂伸长率，夹距为28mm，拉伸速度为20mm/min。

1.6 胶囊用共混膜的结晶结构测试条件

运用全自动XPERT PRO MPD射线衍射仪，设定管电压40kV，管电流35mA，扫描速度2（°）/min，使用CuKα射线，通过超能探测计数器记录得到2θ=5°～45°间共混膜的X 射线衍射曲线。

1.7 胶囊用共混膜的人工消化液崩解实验

人工胃液的配置[15]：2g NaCl， 7mL HCl、0.32g胃蛋白酶（10000unit/mg）混合，定容至1L，用1.0mol/L HCl调节pH值至1.2。

人工肠液的配置[16]：磷酸二氢钾（KH2PO4）6.8g，蒸馏水定容至500mL，然后用0.1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至6.8;称取胰酶10g，加入适量蒸馏水溶解，将pH值为6.8的KH2PO4溶液与胰酶溶液混合均匀，加蒸馏水定容至1000mL，即制成pH值为6.8的人工肠液。

胶囊崩解方案：每种比例的共混膜剪取0.06g左右放入10mL离心管中，加入7mL人工胃液，放入37℃恒温震荡水箱中，每组平行样15个，间隔1h观察，一旦崩解的平行样个数超过平行样总数的1/3则认定此组共混膜崩解，此段时间为胃液崩解时间。若在人工胃液4h还未崩解（模拟胃排空时间），则将膜取出洗净，放入10mL离心管中，加入7mL人工肠液，按上述方法测肠液崩解时间。已经发生崩解的共混膜不再进行后续实验。

1.8 细胞培养实验

为了检测材料植入人体后与人体相容的程度，证明材料是否会对人体组织造成毒害作用。本研究取对数生长期的3T3成纤维细胞，浓度2×104cell/mL加入96孔組织培养板，DMEM高糖培养基培养细胞。培养板中含有各种比例的共混膜，对照组为空白培养板，纯丝胶溶液、纯丝素溶液。将接种了3T3细胞的培养板放置于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养，每隔1d换液。

培养至1、3、5、7d，吸出原培养液，每孔分别加入200μL含10%阿尔玛蓝的DMEM高糖培养基，孵育6h后，吸出180μL阿尔玛蓝培养液到96孔酶标板中，用酶标仪上测出各个孔的荧光值（FLU），激发波长530nm，发射波长590nm[17 18]。

2 结果与分析

2.1 胶囊用共混膜的结晶结构

图1为采用X 射线衍射测试不同比例制备的胶囊膜的结晶结构。

家蚕丝素蛋白silkⅠ结构的衍射峰主要出现在12.2°、19.7°、24.7°、28.2°、32.3°、36.8°、40.1°;silkⅡ结构的衍射峰主要出现在9.1°、18.9°、20.7°、243°[11]。如图1（a）所示，添加甲酰胺的丝素膜和乙二醇的丝素膜的位于9.1°、19.7°和24.3°处的衍射峰峰形，表明silkⅠ和silkⅡ结晶结构同时存在，但添加甲酰胺的共混膜比添加乙二醇的共混膜峰形更加尖锐，可见其结晶结构更加致密规整;同时对比添加脯氨酸的共混膜结晶峰出现在12.2°和19.7°处，此时主要为silkⅠ结晶结构，因此添加乙二醇的共混膜比添加脯氨酸的共混膜的结晶结构紧密。如图1（b）所示，添加脯氨酸的共混膜结晶峰出现在12.2°和19.7°处，此时主要为silkⅠ结晶结构;添加甲酰胺的共混膜和纯丝素膜的衍射峰出现在12.2°、19.7°和24.3°，表明silkⅠ和silk Ⅱ结晶结构同时存在，但添加甲酰胺的共混膜衍射峰相对于纯丝素膜的衍射峰峰形更加尖锐，说明添加甲酰胺的共混膜结晶结构相较于纯丝素膜更加规整;添加乙二醇的共混膜衍射峰出现在12.2°、20.7°和24.3°，silk Ⅰ和silkⅡ两种结晶结构也同时存在;而纯丝胶膜中衍射峰出现在12.2°和28.2°，且19.7°接近于馒头峰，分子聚集态结构主要为无定形和silkⅠ结晶结构。

2.2 胶囊用共混膜的热水溶失率

图2为共混膜的热水溶失率。

浇铸法共混膜制备过程中，所有的分子都是水溶性的，干燥后形成的共混膜，如果没有结构的变化，也将是水溶性的。小分子结构调节剂的加入，是为了改变蛋白质的聚集态结构，促使形成一些结晶交联点，以使蛋白质不溶于水。共混膜浸于水中后，小分子可能溶出，组成膜的蛋白质也会有部分溶出，形成质量的损失。但是小分子的溶出对于膜的力学性能影响不大，共混膜会继续保持完整，具有一定的力学性能。而组成膜的蛋白质溶失过多的话，则膜的完整性会破坏，造成胶囊的崩解，因此胶囊膜的蛋白溶失率不能太大。

由图2可知，制备的共混膜在水中的蛋白溶失率和质量溶失率基本上都是按照膜中所含丝胶比例的减少而逐渐降低的，这是因为丝胶具有很好的水溶性。共混膜的质量溶失率都高于蛋白溶失率，可见共混膜中的小分子溶出，造成比较大的质量溶失率。如果只考虑蛋白溶出率的话，添加甲酰胺的共混膜蛋白溶出率比较低，添加脯氨酸的共混膜溶出率最高。此外，从曲线上进行对比可以看出，脯氨酸膜和乙二醇膜的质量溶失率在每个比例上都要明显高于甲酰胺的，这是由于脯氨酸膜形成silkⅠ结晶结构而乙二醇膜形成silk Ⅱ结晶结构和甲酰胺形成的化学交联结构所导致的。化学交联的增加极大地降低了蛋白质溶失率。

2.3 胶囊用共混膜的力学性能

由于纯丝胶所成的膜硬而脆，因此含有较高比例的丝胶膜（丝胶︰丝素︰小分子=100︰0︰30、80︰20︰30），同样硬而脆，难以用压膜器具制成标准工字型测试样，所以没有提供力学性能数据（表1）。表2为不同比例下共混膜的显著性比较。

从表1可以看出，对于加入不同小分子的共混膜来说，无论干态还湿态，加入甲酰胺分子的共混膜断裂强度高于加入乙二醇和脯氨酸分子的，其中加入脯氨酸分子的断裂强度最低。对于同一种小分子共混膜来说，随着丝胶含量的增加和小分子含量的增加，共混膜的干态和湿态断裂强度基本上都是下降的。干态条件下，随着丝胶及小分子含量的增加，三种膜的断裂伸长率先上升后降低，脯氨酸膜是先降低后上升;湿态条件下，随着丝胶及小分子含量的增加，添加甲酰胺分子的断裂伸长率先上升后下降，添加乙二醇的断裂伸长率逐渐下降，添加脯氨酸分子的断裂伸长率先下降后上升。综上所述，添加脯氨酸的共混膜表现出更佳的柔韧性，添加甲酰胺的共混膜强度高，但韧性不足。在湿态条件下乙二醇共混膜表现出较好的柔韧性。

从表2可以看出，无论干态还是湿态条件下，不同比例下的膜片断裂强度断裂伸长率有很大显著性差异;湿态条件下，各比例下的膜片断裂伸长率存在很大的显著性差异，而断裂强度除50︰50︰甲酰胺和50︰50︰脯氨酸存在一定的显著性，但不如其他各比例下共混膜的显著性差异性大。

2.4 胶囊用共混膜的体外崩解实验结果

共混膜在胃液、肠液中的崩解时间如表3所示。实验时，0～4h这段时间内共混膜浸泡在人工胃液中，4～12h共混膜浸泡在人工肠液中，结果显示12h内所有的共混膜都发生崩解。

由表3可以看出，丝胶蛋白含量高的共混膜容易在胃液中发生崩解，随着丝素蛋白含量提高，共混膜在胃液中不发生崩解，而在肠液中发生崩解。出现这种现象是因为丝胶蛋白亲水性比较强，当共混膜浸泡在胃液中，受到盐酸的水解作用，丝胶蛋白容易被溶失，整个膜的结构遭到破坏从而崩解。丝胶︰丝素=100︰0、80︰20的共混膜在4h内发生崩解。其余比例的共混膜中丝素含量较高，丝素蛋白结构相对比较规整，不容易被低浓度的盐酸水解而发生崩解。其后浸入人工肠液中，丝素蛋白被肠液中的胰蛋白酶降解，从而造成胶囊膜的崩解。从崩解时间上可以看出，甲酰胺/丝素膜的结构最为稳定，崩解时间最长;脯氨酸/丝素膜在肠液中崩解的时间最短，这与不同小分子結构调节剂形成的丝素蛋白膜的结构（silkⅠ、silkⅡ、化学交联）相吻合。因为silkⅠ结晶结构的丝素蛋白更容易被降解，silkⅡ结晶结构则比较致密，降解速度较慢，而化学交联加silkⅡ结晶结构的甲酰胺丝素蛋白膜则崩解最慢。

2.5 胶囊用共混膜上细胞增殖活力的测定

成纤维细胞3T3在丝胶︰丝素=20︰80的共混膜上的增殖活性、显著性检验如图3所示。第一天时各个样品上细胞的生长没有明显差异，各组之间的差异性不明显;到第三天时，细胞生长较缓慢，但添加乙二醇共混膜上的细胞活性明显高于其他共混膜，除甲酰胺膜与SF膜及乙二醇膜与对照组差异性不显著外，其余各组之间差异性显著;第五天时，细胞在添加甲酰胺和乙二醇的共混膜上增殖活性高于其他组，各组之间差异性显著;第七天时，细胞在共混膜和对照组上的荧光值都高于15000，各组之间存在明显差异性，且纯丝素纯丝胶膜上的细胞增殖活性明显高于其他共混膜，可能是由于共混膜上小分子的溶出影响细胞的增殖活性，使得荧光值较低。无论是共混膜还是纯丝素丝胶膜，细胞增值活性比对照组低，主要是细胞与膜之间发生了相互作用的结果。综合来看，共混膜具有良好的生物相容性，能够支持成纤维细胞3T3的正常生长。

3 结 论

本研究制备了丝素/丝胶共混膜，通过加入不同小分子促使蛋白质的聚集态结构改变以获得适合不同消化道崩解的胶囊材料。由于小分子加入促使丝素蛋白形成了不同的结晶结构，因此随着丝胶蛋白在共混膜中比例的下降，共混膜的热水溶失率下降。添加脯氨酸的共混膜表现出更佳的柔韧性，添加甲酰胺的共混膜强度高而但韧性不足。在湿态条件下乙二醇共混膜表现出较好的柔韧性。丝胶蛋白含量高的共混膜在胃液环境中崩解（<4h），适合用作胃溶性胶囊壳材料;丝素蛋白含量高的共混膜在胃液中不崩解，在肠液中崩解（<12h），适合用作肠溶性胶囊壳材料。本研究制备的胶囊膜材料细胞相容性良好，不同小分子的加入可以获得不同崩解时间的胶囊壳材料，适用于不同的崩解要求。

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