胶体金法快速检测猪尿中氟喹诺酮类药物的残留

林少华 罗红霞 许文涛 寥国周 商 颖 葛长荣*

（1北京农业职业学院，北京 102442；2中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；3云南农业大学食品科学技术学院，云南昆明 650201；4昆明理工大学食品安全研究院，云南昆明 650093）

为了保证消费者的饮食卫生与食用安全，中国规定了动物源食品中兽药的最大残留限量（Maximum Residue Limits,MRL）[1]，然而随着兽药的广泛使用，引起了人们一系列的不良反应，对人体和动物的机体造成了一定的损伤，因此，兽药在动物源食品中的残留问题越来越受到人们的关注。氟喹诺酮类药物（Fluoroquinolones,FQs）是一类近年来被广泛应用的对许多细菌具有抑制作用的人工合成兽药[2]，它对金黄色葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、衣原体、支原体、螺旋体等致病菌具有极强的抑制作用，适用于临床常见的各种细菌感染性疾病，已成为继青霉素类药物和磺胺类药物之后治疗畜禽疾病的第三代喹诺酮类药物[3]。然而，长期使用FQs会积累在动物体内，当身体的累积摄入量超过限制时，中毒症状如皮肤过敏、出血和肾功能衰竭等不良反应[4]将会出现，并会诱发精神病及癫痫患者发病[5]，具有潜在的致癌性[6]等。因此，氟喹诺酮类药物已经被大多数国家禁止或限制使用。

目前，关于氟喹诺酮类药物残留的检测方法主要有微生物法、化学发光法、液相色谱-质谱联用法和免疫分析法[7-11]。胶体金免疫层析法是一种利用胶体金作为标记物并基于抗原抗体反应进行检测的技术，该技术操作简单快速，可直观判断检测结果[12]。目前，已有的研究包括了肉、蛋、奶的FQs胶体金免疫层析方法[13-14]，但采用胶体金试纸条对猪尿中的FQs直接进行检测，可以解决筛查生猪大规模样品时采用仪器法周期长、对实验操作人员要求高及检测成本昂贵等问题。因此，本文拟建立一种快速检测猪尿中FQs的胶体金免疫层析方法。

1 材料与方法

1.1 材料

恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、依诺沙星、恶喹酸等标准品，氯金酸（HAuCl4·4H2O）、柠檬酸三钠、牛血清白蛋白（BSA），羊抗鼠IgG均购自Sigma公司；FQs单克隆抗体和包被抗原（FQs-OVA）由本实验室制备；硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫、吸收垫均购自美国Millipore公司；其他试剂均为分析纯；猪尿样本采自北京某猪场。

1.2 仪器

Mili-Q超纯水系统购自美国Millipore公司；磁力搅拌器购自上海振荣科学仪器有限公司；试纸条划线仪购自美国Biodot公司；可编程切条器购自杭州峰航科技有限公司；切纸器购自宁波得力集团有限公司；分析天平购自德国Sartorius公司；手持式pH计购自上海般特仪器有限公司；台式离心机购自美国Scilogex公司；生化培养箱DHP-600购自天津市中环实验电炉有限公司；紫外-可见分光光度计购自北京普析通用仪器有限责任公司；透射电子显微镜（TEM）购自美国JEOL公司。

1.3 方法

1.3.1 胶体金溶液的制备

准确称取1.0 g氯金酸，并使用超纯水将其定容于100 mL容量瓶中，制备成浓度为1%的氯金酸溶液，于4℃避光保存备用。配制胶体金溶液时，取1 mL浓度为1%的氯金酸溶液加入到100 mL超纯水中，用磁力搅拌电热器加热至沸腾，然后快速加入2.0 mL现配的体积分数为1%的柠檬酸三钠溶液，保持沸腾10 min，直到液体变红并停止加热，降至室温备用。

1.3.2 胶体金标记抗体的制备

取1 mL胶体金溶液，用0.2 mol/L的K2CO3溶液调节pH值为7.0～7.2，漩涡震荡10 min后，加入适量的FQs单克隆抗体，搅拌30 min后，加入体积分数为10%的1 mL牛血清蛋白（BSA），结合30 min后，将混合溶液在4℃下以12 000 r/min离心20 min，将离心得到的沉淀物溶解于0.1 M的磷酸盐缓冲液中，制备得到胶体金FQs单克隆抗体溶液，并于4℃保存备用。

1.3.3 优化胶体金最佳抗体标记量

每管加入1 mL上述胶体金溶液，分别加入0、2、4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20 μL 浓 度 为1 mg/mL的FQs单克隆抗体，振荡混匀5 min，室温静置10 min；然后加入0.1 mL 10%的NaCl溶液，混匀并静置2 h。然后将该胶体金溶液在4℃以12 000 r/min离心20 min，得到上清液，于520 nm处测定其吸光值。

1.3.4 试纸条的组装

试纸条由材质为玻璃纤维膜的胶体金结合垫、材质为硝酸纤维素膜（NC膜）的层析膜、加样垫及吸水垫组成。胶体金FQs单克隆抗体溶液用喷膜仪喷在结合垫上，并在恒温37℃下烘干，然后真空冻干制成胶体金结合垫备用。用点膜仪将浓度为1 mg/mL的FQs-OVA偶联物包被于NC膜上，制成T线检测线，在距离T线4mm处，用点膜仪将浓度为1 mg/mL的羊抗鼠二抗包被于NC膜上，制成C线质控线，然后置于37℃烘干3 h。最后以PVC板作背衬，按顺序粘上样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫组装成检测试纸条。样品吸收垫的末端与结合垫始端相连，结合垫的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，试纸两端粘贴有保护膜，切成4 mm宽的试纸条，密封好后放入4℃保存备用。

1.3.5 检测原理及结果判断

由土地综合承载力方程可知，地均第二、第三产业增加值以及两者的联合发展都不是土地综合承载力的Granger原因。但在10%显著性水平下，人均GDP是土地综合承载力的Granger原因。这表明土地综合承载力主要受人口承载力、资源环境承载力、经济社会承载力及科技文化承载力4个构成要素的影响，客观上来看，土地综合承载力与人均GDP之间的因果关系日趋显现。

当样品中含有FQs时，胶体金FQs单克隆抗体标记物与FQs结合，不与FQs-OVA偶联物结合而未出现红色条带。基于上述原理，当T线和C线均出现红色条带时，判为阴性；当C线出现红色条带，而T线不显色，判为阳性；当C线显示红色条带，T线也显示红色条带，并且T线颜色接近或浅于C线时，则判为阴性；当C线不显示红色条带，则无论T线是否显示红色条带，都判为无效（图1）。

图1 试纸条检测结果示意图

1.3.6 猪尿样品检测程序

取100 μL存放于4℃冰箱的猪尿样品，该样品无需进行前处理，用吸管吸取待检样品溶液滴加3滴到试纸条的加样孔中，通过观察T线和C线的颜色变化判定结果。

1.3.7 试纸条的检出限

分别向阴性猪尿样品中添加恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、依诺沙星和恶喹酸标准品，使得它们的质量浓度分别为10、20、30、40 μg/L。通过观察试纸条T线和C线的颜色变化情况对结果进行判断。

1.3.8 试纸条的特异性

将常用的兽药如氯霉素、红霉素、庆大霉素、四环素等按照质量浓度为500 μg/L分别加入到阴性猪尿中，然后用试纸条重复检测3次，以确定试纸条的特异性。

1.3.9 试纸条的稳定性

将制备好的试纸条密封包装在铝箔袋中，分别进行37℃加速试验和4℃储存试验。将制备好的试纸条置于37℃，分别在10、20、40、80、160、320天取出，检测添加了质量浓度为0、20、40 μg/L恩诺沙星标准品的阴性猪尿样品，每组3个平行。将置于4℃下的试纸条，于1、4、8、12、16、20、24个月取出，检测添加了质量浓度为0、20、40 μg/L恩诺沙星标准品的阴性猪尿样品，每组3个平行。

2 结果与讨论

2.1 胶体金及其FQs单克隆抗体的表征

本研究制备的胶体金纳米颗粒及胶体金FQs单克隆抗体表征结果如图2所示。利用透射电子显微镜（TEM）对金纳米颗粒和胶体金FQs单克隆抗体的宏观形貌进行了表征，可以清晰看到金纳米颗粒分散性良好，尺寸约为40 nm；胶体金FQs单克隆抗体在金纳米颗粒周围出现明亮的圆圈，表明抗体修饰成功。

图2 金纳米颗粒和胶体金FQs单克隆抗体的表征

为了进一步验证抗体的成功修饰，测试了金纳米颗粒和胶体金FQs单克隆抗体的紫外-可见吸收光谱的变化。金纳米颗粒的最大吸收波长为520 nm，而胶体金FQs单克隆抗体最大吸收波长为524 nm，峰值的变化表明抗体修饰成功（图3）。

图3 金纳米颗粒和胶体金FQs单克隆抗体溶液的紫外-可见光扫描图谱

2.2 胶体金最佳标记抗体的量

实验结果表明，随着抗体量的增加，胶体金溶液的颜色由酒红色缓慢变为蓝灰色，表明抗体加入量不能很好地稳定胶体金。当管内胶体金的酒红色不再发生明显变化时，表明该抗体加入量可以较好地稳定胶体金。由图4可以看出，随着抗体加入量的增加，金颗粒与蛋白的结合物在520 nm处的吸光值也增加，当FQs单克隆抗体加入量在10 μL时，OD520nm值基本趋于稳定，说明金颗粒结合的抗体蛋白已经饱和。

2.3 试纸条的检测限

当该试纸条用于检测含有浓度低于20 μg/L的恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、依诺沙星和恶喹酸的猪尿样品时，试纸条T线和C线均显色，为阴性，而浓度高于20 μg/L时，该试纸条的T线不显色而C线显色，为阳性，因此检出限为20 μg/L。

图4 不同FQs加入量胶体金的OD值

2.4 试纸条的特异性

结果显示，采用试纸条分别检测含有浓度为500 μg/L的氯霉素、红霉素、庆大霉素、四环素的猪尿时，试纸条C线和T线均显色，因此，本试纸条未对这些药物发生交叉反应。

2.5 试纸条的稳定性

试纸条的稳定性结果如表1和表2所示。在37℃加速试验时，该试纸条在160天时测定了含有浓度为20 μg/L恩诺沙星标准品的猪尿样品，有2份已经失效；测定了含有浓度为40 μg/L恩诺沙星的猪尿样品，有1份已经失效。到了320天时，所有试纸条均失效。4℃保存试验时，氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸条可以保存24个月。

表1 37℃加速试验结果

3 结果与讨论

影响胶体金试纸条质量的主要因素包括胶体金颗粒的尺寸、胶体金标记的抗体量。当胶体金的颗粒较大时，会产生一定的空间位阻，不利于样品的毛细管迁移，降低试纸条的检测时间和检出限；但如果胶体金的颗粒太小，难以标记更多的单克隆抗体，也会降低试纸条的检测灵敏性。本文采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，利用透射电子显微镜对金纳米颗粒和胶体金FQs单克隆抗体进行表征，确定所制备的胶体金颗粒及其标记的单克隆抗体均一，平均直径为40 nm；通过紫外-分光光度计扫描得到胶体金FQs单克隆抗体最大吸收波长为524 nm。另外，胶体金的标记抗体量也非常关键，抗体标记量过低时会产生游离的胶体金，使得胶体金标记的单克隆抗体溶液不稳定，从而降低检测结果的稳定性，同时，显色条带较浅，容易产生结果误判；抗体标记量过高时，会导致抗体的浪费，并降低检测结果的灵敏性，因此，本试纸条加入的浓度为1 mg/mL的FQs单克隆抗体量为10 μL。该方法制备的试纸条对含有恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、依诺沙星和恶喹酸等药物的猪尿样品的检出限为20 μg/L，且检测的特异性高，在37℃时可以保存160天左右，在4℃时，可以保存24个月。

表2 4℃保存试验结果