CO2增施对四川弱光区设施黄瓜叶片光系统功能及其产量的影响

张泽锦，唐 丽*，李跃建，刘小俊

(1. 四川省农业科学院园艺研究所/蔬菜种质与品种创新四川省重点实验室，四川 成都 610066；2. 农业部西南地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，四川 成都 610066)

【研究意义】二氧化碳(CO2)排放引起的全球气候变化严重影响着人类的生存和发展，是国际社会面临的重大挑战，但CO2同时又是植物生长过程中有机物形成的碳源，光合作用的反应底物，其浓度的变化直接影响植物光合生理生化过程。蔬菜作物干物质产量的90 %～95 %则是由光合作用所制造[1]，刘保才等(1995)用通径分析证明，影响日光温室蔬菜产量的三大环境因素中，CO2浓度对产量形成贡献最大[2]。【前人研究进展】黄瓜是设施栽培的主要作物品种之一，我国北方设施黄瓜占设施面积的50 %～60 %，专业种植区甚至高达80 %以上[3]。位于中国的西南地区的四川盆地全年的平均太阳辐射小于1500 MJ·m-2，属于中国光照资源5类地区[4]。黄瓜是该地区设施栽培的主要品种之一，约占四川设施栽培面积25.9 %。【本研究切入点】有关CO2的施肥技术国内外已经做了相关研究[5]，关于黄瓜的光合作用前人分别从气体交换、光合关键酶及生长发育等方面做了大量工作[6-7]，但其中关于叶片光系统功能的研究主要集中在光系统II(PSII)进行叶绿素荧光的探讨[8-10]，对于光系统I(PSI)和跨膜质子梯度的影响却鲜有报道，CO2浓度升高对黄瓜叶片2个光合系统影响的机理尚未明确；此外，有关CO2增施对黄瓜生长等方面的研究主要集中在北方密闭性较好且光照充足的日光温室中，但针对南方弱光地区生产大量采用密闭性较差的塑料大棚中黄瓜生产类似研究较少，经济适用且易于推广的CO2施肥方式缺乏相应推广应用的理论支撑。【拟解决的关键问题】为了进一步明确CO2增施对弱光区黄瓜叶片光系统功能的作用机制和吊袋式CO2增施技术在设施黄瓜促成生产中的应用价值，本试验研究CO2增施对黄瓜叶片PSI、PSII、跨膜质子梯度以及产量的影响，为四川弱光区设施黄瓜促成高产栽培技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试验设计

试验于2016年1-7月在四川省农业科学院园艺研究所塑料大棚进行。以黄瓜(品种：川翠3号)为实验材料，育苗于2月1日进行，待黄瓜苗长到三叶一心时，定植于塑料大棚中(长30 m，宽8 m)，1周后进行实验处理。CO2增施期间光照强度最高为1212 μmol·m-2·s-1。CO2增施采用吊袋式CO2气肥的增施方法，每包CO2发生剂重110 g，1个塑料大棚均匀吊挂16个CO2施肥袋，每个施肥袋吊挂位置距地面1.5 m处。另外1个大棚无CO2吊袋设为CK，每隔15 d更换1次CO2增施包。晴天CO2增施棚内CO2浓度最高约为550 μmol·mol-1，最低浓度约为320 μmol·mol-1，对照棚内最高CO2浓度为480 μmol·mol-1，最低CO2浓度为310 μmol·mol-1；阴天CO2增施棚内CO2浓度最高约为510 μmol·mol-1，最低浓度约为400 μmol·mol-1，对照棚内最高CO2浓度为470 μmol·mol-1，最低CO2浓度为380 μmol·mol-1。大棚内设置3个实验重复，每个小区20株黄瓜，面积6 m2。由于气温的逐渐升高，CO2增施于4月30日结束。3-4月根据天气状况白天10：00左右进行开启大棚天窗进行放风除湿。两个棚内黄瓜施肥按照常规处理进行。

1.2 测定项目及方法

1.2.1 叶片叶绿素含量及叶面积测定 本试验于CO2增施时(3月18日和4月3日)和CO2增施结束后(5月11日和5月14日)，选取植株中部的黄瓜叶片参照杨劲峰等(2002)方法进行叶面积测量[11]；叶片叶绿素含量采用丙酮法进行测定。

1.2.2 气体交换参数的测定 本试验于4月上旬，选择晴天对黄瓜叶片光合特性进行测定。黄瓜叶片光合速率测定用便携式光合作用测量系统(LI-6400，LI-COR公司，美国)，对试验区内选取的5株黄瓜，测定植株中部叶片的光响应曲线。将待测叶片在该光强下放置30 min以充分活化光合系统。使用开放气路，空气流速控制为500 μmol·s-1，CO2浓度400 μmol·mol-1。从高到低设定光照强度的梯度为：1800、1500、1200、1100、1000、800、600、400、200、100、50、20、0 μmol·m-2·s-1，测定时每一光强下停留3 min。采用非直线双曲线模型拟合光响应曲线，并计算光补偿点(Ls)、光饱和点(Lc)，表观量子效率(AQE)、暗呼吸速率(Rd)及最大光合速率(Pmax)相关光响应参数[12]。

1.2.3 叶片荧光参数的测定 光系统诱导荧光曲线的测量：黄瓜叶片暗适应2 h的叶片，利用双通道荧光仪dual-PAM100(Walz，德国)中诱导曲线测量程序测定诱导荧光曲线，Actinic light设置为8档。

光响应荧光曲线的测量：在使用光适应的叶片，利用双通道荧光仪Dual-PAM-100(Walz，德国)中light curve测量程序测定黄叶片PSII和PSI快速荧光响应曲线。测量结束后采用EP拟合模型对其拟合，自动计算相关参数。

快速叶绿素荧光诱导动力学曲线的测量：利用双通道荧光仪Dual-PAM-100(Walz，德国)自动测量程序，在叶片暗适应180 min后测定黄瓜叶片快速叶绿素荧光诱导动力学曲线，JIP-test参数根据Strasser等(2000)计算得到[13]。

暗光暗诱导的550～515 nm差示信号测定：根据Schreiber and Klughammer(2008)方法，利用双通道荧光仪dual-PAM-100的P515/535模块系统及其自动程序测定[14]。黄瓜叶片暗适应后开始测量，10 s开启光强为274 μmol·m-2·s-1的光化光进行光照，并持续至300 s关闭光照，全部测量过程于400 s时结束。根据曲线计算得出跨膜质子动力势(pmf)，跨膜电位(Δψ)跨膜质子梯度(ΔpH)化及玉米黄素相对含量(Z)。

表1 CO2增施对黄瓜叶片PSI和PSII量子产量及电子传递速率的影响(n=12)

1.3 数据分析

试验数据的处理及分析利用Microsoft Excel 2010和SPSS 18.0软件完成。分别对各试验区的试验数据进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 CO2增施对叶片光合系统I和光合系统II的影响

CO2增施处理中PSI的量子产量[Y(I)]、相对电子传递速率[ETR(I)]以及由于受体侧限制引起的PSI处非光化学能量耗散的量子产量[Y(NA)]与对照黄瓜叶片无显著差异，但CO2增施处理供体侧引起的由于供体侧限制引起的PSI处非光化学能量耗散的量子产量[Y(ND)]显著低于对照，为对照处理的97.2 %。PSII的量子产量[Y(II)]、相对电子传递速率[ETR(II)]以及光保护和光损伤的2个参数PSII处非调节性能量耗散的量子产量[Y(NO)]和PSII处调节性能量耗散的量子产量[Y(NPQ)]在CO2增施处理和对照间均无显著差异(表1)。

通过荧光响应曲线的测量，采用Eilers and Peeters(1998)的公式进行光响应曲线的拟合得到快速光曲线的初始斜率(α)、最大电子传递速率(ETRmax)及最小饱和光强(IK)。α反应光能利用效率，ETRmax和IK反应样品对强光的耐受能力[15]。从表2可以看出，CO2增施提高了PSII和PSI的ETRmax以及PSI的IK，分别比对照提高了40.2 %，28.4 %及20.4 %。CO2增施未提高PSII和PSI的快速荧光初始斜率和PSII的最小饱和光强(IK)。

2.2 CO2增施对叶片光合系统II能量分配的影响

初始荧光(Fo)是PSII作用中心完全开放即所有的电子受体QA、QB和PQ等最大程度氧化态时的荧光产量，此时的荧光强弱与天线色素含量的多少及作用中心的活性状态有关。天线色素降解和非光化学能量耗散易造成Fo的降低，而光合机构的可逆失活又使其升高。黄瓜CO2增施处理的初始荧光Fo与未增施的对照Fo分别为0.20和0.19，无显著差异，最大光化学效率Fv/Fm反应了潜在的量子效率，CO2增施和对照分别为0.80和0.79，无显著差异。

表2 CO2增施对黄瓜叶片光响应荧光参数的影响(n=12)

表3 CO2增施对黄瓜叶片叶绿素荧光响应参数的影响(n=12)

从PSII中能量分配来看，CO2增施处理黄瓜叶片反应中心捕获的用于电子传递的能量(ETo/RC)为1.70，比对照显著增加了7.6 %；而处理与对照的黄瓜叶片单位反应中心吸收的光能(ABS/RC)，单位反应中心捕获的用于还原QA的能量(TRo/RC)以及单位反应中心热耗散的能量(DIo/RC)无显著差异。以上结果表明，CO2增施黄瓜叶片PSII反应中心捕获的用于电子传递的能量显著增加(ETo/RC)可能是导致光反应最大电子传递速率的提高的原因之一。

PIABS指以吸收光能为基础的性能指数，由捕获的激子将电子传递到电子传递链中超过QA的其它电子受体概率(ψo)、光合活性反应中心的数目(RC/ABS)和最大光化学效率(φPo)3个参数组成。

图1 黄瓜叶片暗-光-暗诱导的550～515差示信号的变化Fig.1 Effect of CO2 enrichment on slow dark-light-dark induction transients of the 550-515 nm difference signal of cucumber leaves

CO2增施处理的RC/ABS比对照处理增加25 %；ψo和φPo 2个参数处理与对照之间无显著差异。CO2增施处理的黄瓜叶片PIABS比CK显著提高了11.0 %。因此，CO2增施使黄瓜叶片单位面积上光合活性反应中心的数目显著增加可能是提高其叶片光合的性能指数增高的主要原因(表3)。

2.3 CO2增施对叶片跨膜质子动力势的影响

在光化光关闭后，暗-光-暗诱导的550～515 nm差示信号先下降后上升，从550～515 nm差示信号曲线变化可得出跨膜质子梯度(ΔpH)、跨膜电位(Δψ)、跨膜质子动力势(pmf)及可逆玉米黄素(Zeaxanthin，Z)相对含量的变化。

黄瓜叶片暗适应时与经过照光关灯后测量结束时550～515 nm差示信号的差值代表叶片可逆玉米黄素相对含量。如图1和表4所示，CO2增施处理后“暗基线”的增加显著高于对照，玉米黄素相对含量为16.63，比对照增加34.7 %，CO2增施处理促进了可逆玉米黄素的形成。以上结果说明CO2处理的黄瓜叶片比对照具有更强减轻黄瓜叶片光氧化胁迫的能力。

光化光关闭后的550～515 nm差示信号曲线变化，可反映叶片Δψ及ΔpH大小。光化光照射达到稳定时550～515 nm差示信号与关闭光化光并达到稳态后550～515 nm差示信号的差值，反映叶片类囊体膜Δψ相对大小；关闭光化光达到稳态后P515信号与关闭光化光后信号下降的最低点差值反映类囊体膜ΔpH相对大小[16-17]。CO2增施显著提高了Δψ和pmf，分别比对照处理提高29.8 %和19.2 %；两处理的ΔpH无显著差异。pmf增高的主要原因是由于Δψ的增高，因为较高的Δψ提高了类囊体膜上的代谢活性及蛋白运转，同时提高了膜的渗透性。

表4CO2增施对黄瓜叶片跨膜质子参数的影响(n=12)

Table 4 Effect of CO2enrichment on membrane potential (Δψ), proton gradient (ΔpH), proton motive force (pmf) and relative content of xeaxanthin(n=12)

ΔψΔpHpmf玉米黄素相对含量Relative content of xeaxanthinCO2增施CO2 enrichment4.97± 0.385.13± 0.7610.10±0.4616.63±1.97CK3.83± 0.254.63± 0.808.47±0.9512.35±1.65ANOVA∗NS∗∗

表5 CO2增施对黄瓜叶片光响应气体交换参数的影响(n=6)

2.4 CO2增施对叶片光响应气体交换参数的影响

由表5可以看出，CO2处理显著提高了黄瓜叶片的表观量子效率(AQE)，比对照提高了16.7 %；暗呼吸速率(Rd)同时也显著提高，是对照处理的1.24倍。光饱和点，光补偿点及最大光合速率则处理与对照无显著差异。

2.5 CO2增施对黄瓜叶面积和叶绿素含量的影响

由表6可以看出，4月3日测定CO2增施处理黄瓜叶片的叶绿素b和总叶绿素含量分别为1.37和5.23 mg·g-1，显著高于对照处理，分别是对照处理的1.3和1.1倍。但CO2增施处理黄瓜叶片的叶绿素a/b为2.00，显著低于对照处理，是对照处理的74.3 %。5月14日测定黄瓜叶片叶绿素含量各指标CO2增施处理与对照无显著差异。

由图2可以看出，3月15日CO2增施和对照处理的黄瓜叶面积分别为45.0和24.0 m2，CO2增施处理的黄瓜叶面积比对照增加了87.5 %。5月11日测量CO2增施处理和对照处理的黄瓜叶面积分别为221.7和200.5 m2，无显著差异。4月底以后由于气温的上升，塑料大棚均未闭棚，CO2增施棚的CO2浓度与对照棚内CO2浓度均为大气浓度，因此5月CO2增施和对照处理之间黄瓜中部叶片的叶绿素含量与叶面积无显著差异。

2.6 CO2增施对黄瓜产量的影响

由表7可以看出，CO2增施提高了黄瓜单果重，收获期平均单果重为0.32 kg，显著高于对照处理的0.24 kg。收获期结束后，测量黄瓜植株长。单株果数和小区总产量，CO2增施处理黄瓜植株长和单株果数分别为257.5 cm和7.2，显著高于对照处理的185.8 cm和5.4，是对照处理的1.4和1.3倍；CO2增施处理黄瓜小区总产量为43.3 kg，比对照增产73.8 %。以上结果表明，CO2增施提高黄瓜产量，可能是通过增加植株长，增加单株结果数和提高单果重来实现。

表6 CO2增施对黄瓜叶片叶绿素含量的影响(n=15)

表7 CO2增施对黄瓜生长和产量的影响(单果重、单株果数及植株长n=12；小区产量n=3)

图2 CO2增施对黄瓜叶面积的影响(n=15)Fig.2 Effect of CO2 enrichment on leave area of cucumber (n=15)

3 讨 论

光合作用中较强的CO2传导能力，较高的光反应和暗反应活性是叶片提高光合速率的生理基础[18]。CO2不仅是植物光合作用的主要原料，还是作物产量的形成的重要来源。短期提高CO2浓度不但增加了植物光合作用的碳源，还提高了C3植物的光合速率[19]。温室内CO2浓度由200 μmol·mol-1提高到400 μmol·mol-1时，设施内黄瓜、番茄和辣椒的净光合速率提高55 %～130 %[20]。本研究发现，CO2增施时期使得黄瓜叶片叶面积和叶绿素含量增高，而叶绿素a/b下降，更好地利用散射光，在弱光条件下提高叶片净光合速率[21]，这与魏珉等(2003)[22]、郭卫华等(2004)[23]、宝俐等(2016)[24]等报道类似。CO2增高使得黄瓜叶片表观量子效率(AQE)增高。表观量子效率(AQE)值为弱光阶段的光响应曲线的斜率，其值大小与色素蛋白复合体数目相关。CO2升高后的黄瓜叶片总叶绿素含量和叶绿素b含量的增高则是导致其利用弱光的能力增强的主要原因。叶片光利用率的提高，有助于减轻西南地区早春的弱光环境对黄瓜生长产生的胁迫。

与植物叶片“表观性”的气体交换参数净光合速率相比，光合荧光参数具有反应光合作用“内在性”特点。本研究发现，CO2升高提高了黄瓜叶片内的两个光系统的最大电子传递速率，降低了由于供体侧限制引起的PSI处非光化学能量耗散的量子产量[Y(ND)]，PSI具有接受更多的电子在供体侧用于光合作用电子传递的能力，从而引起叶片的PSI的最小饱和光强(IK)增大。此外，PSⅡ和PSI的最大电子传递速率的提升，更多的光能用于电子链中的电子传递，为叶片暗反应提供更多的能量。

Fv/Fm代表原初光能转化效率，本次试验CO2升高并未使黄瓜叶片的原初光能转化效率增高，这与魏珉等(2000)在黄瓜幼苗上报道CO2升高提高黄瓜叶片原初光能转化效率0.98 %～1.72 %有所不同[25]，与王晨光等(2015)在大豆上的研究结果类似[26]，这可能与黄瓜不同生长时期对CO2敏感度有关。Maxwell等(2000)认为健康植物的Fv/Fm值较为稳定，为0.83左右，植物受到胁迫Fv/Fm才会降低[27]。但有些研究表明Fv/Fm对胁迫的反应不如PIABS敏感[28-29]。由本实验结果可以看出，对于黄瓜叶片来说，PIABS比Fv/Fm更能灵敏的评价黄瓜叶片的光合性能的变化。

跨膜电势(Δψ)的和跨膜质子势(ΔpH)不仅可以驱动类囊体膜上ATP酶合成ATP[30]，跨膜质子势(ΔpH)还能通过qE机制耗散过多光能，下调光合效率，从而起到调节光合能力的作用[31]。本试验中，CO2升高导致黄瓜叶片跨膜电位(Δψ)增高，这说明促进了玉米黄质的形成，通过类囊体ATP酶从腔内流向基质的H+的量增多。光合作用中另外提供能量的则是内囊体薄膜上的跨膜质子梯度所构成，CO2增施显著的提高了跨膜质子动力势(pmf)，而跨膜电位(Δψ)则是pmf提高的根本原因。更多的氢离子通过跨膜质子动力势的增多而进入内囊体膜，从而通过ATPase流出，产生更多的ATP用于暗反应的能量供应。

与前人报道单株结果数增加，但单果重并无显著差异是苗期CO2增施黄瓜增产的主要原因有所不同[8]，本实验黄瓜除了单株果数增加，单果重也有较大幅度增加。由于本实验在黄瓜定植一周后增施CO2，导致前期叶片弱光捕获能力增加，同时叶片PSII和PSI活性增强，将捕捉到的光能高效的转化为化学能，产生更多的ATP用于暗反应的能量供给，促进了黄瓜叶片CO2同化能力的增加，为前期黄瓜生长奠定了良好的物质基础；此外，CO2增施增加了黄瓜花芽的分化，增加了开花数，从而导致单株坐果数的增加，最终导致黄瓜产量的增加。这与番茄叶片在CO2增加的环境中具有较高的CO2同化和运转效率，同化产物运转至果实促进了坐果和果实发育类似[32-33]。由此可见，在春季黄瓜塑料大棚促成栽培过程中从定植后开始增施CO2能显著的提高其产量。

4 结 论

CO2增施增加了黄瓜的叶面积、光合色素量、2个光系统的电子传递效率及类囊体的跨膜质子梯度，叶片接受的光能更多的用于CO2同化作用，同时提高了黄瓜叶片的弱光利用率和抗光氧化的能力，最终通过增加单果重和单株结果导致其产量的增加。此外，本实验结果可以看出，操作简单且成本较低的吊袋式施肥方式，因其增产效果明显，在四川弱光地区春季黄瓜促成栽培中具有较好的应用前景。