天漠嗜盐和耐盐细菌产淀粉酶活性及菌株多样性*

杨玉婷，吴秋蕾，张 俊，张 丽，贺建武，刘祝祥，陈义光

(吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南 吉首 416000)

按照对盐分的依赖程度、耐受浓度以及最适生长浓度的不同，微生物可以分为非嗜盐微生物、耐盐微生物和嗜盐微生物.[1-3]嗜盐微生物通常是指生活在高盐环境(盐湖、海洋、晒盐场和盐碱地等)中的微生物类群，属于极端微生物.[4]由于独特的基因类型和特殊的代谢途径，嗜盐和耐盐菌在食品、化工等方面具有广阔的应用前景.[5-7]

淀粉酶是可以催化淀粉和糖原进行水解反应并转化成葡萄糖及其他低聚糖的一类酶的总称.动物、植物和微生物都产生淀粉酶，其特征各不同，种类繁多.淀粉酶制剂是目前产量最大、应用颇广的一种酶制剂，主要应用于酿造、医药、纺织、食品加工等行业领域[8-11].淀粉酶自1883年被分离出来以后，有关学者已对其进行了大量的研究，但是对嗜盐耐盐菌产生的淀粉酶活性及菌株系统发育多样性的研究较少.为深入研究、保护和开发利用该类微生物资源，笔者以分离自张家口天漠沙土中的嗜盐和耐盐细菌(含放线菌，以下简称嗜盐和耐盐菌)为研究对象，采用平板水解圈法(Plate Hydrolysis Spot Method)对其产生的淀粉酶进行活性筛选，并采用16S rRNA基因序列分析法对阳性菌株进行系统发育多样性分析.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 实验菌株共76株嗜盐和耐盐细菌(含放线菌)，最低能耐受NaCl质量浓度100 g/L，由吉首大学微生物资源与生态实验室于2017年9月分离自河北省张家口市天漠沙土.

1.1.2 培养基 (1)MA10培养基：NaCl 100.0 g，MgCl2·6H2O 5.9 g，Na2SO43.2 g，CaCl21.9 g，蛋白胨5.0 g，酵母膏1.0 g，复合盐A液20 mL，复合盐B液1 mL，琼脂20.0 g，H2O 1 L，pH值7.5～8.0.复合盐A液:Na2CO38.0 g，KCl 27.5 g,Ferric citrate 5.0 g，H2O 1 L.复合盐B液：KBr 80.0 g，H3BO322.0 g，Na2HPO48.0 g,Na2SiO34.0 g，SrCl34.0 g，(NH4)2SO41.6 g，H2O 1 L.(2)淀粉水解培养基：按照MA10培养基配方，加入0.2%可溶性淀粉(先用少量水溶解).

1.1.3 主要试剂与仪器 主要试剂：卢哥氏碘液(按文献[12]配制)；可溶性淀粉(分析纯)；PCR引物、试剂和Taq酶均购自生工生物工程(上海)有限公司.

主要仪器：生物安全柜(BSC-04IIB2，苏净安泰)；恒温培养箱(IS-RDD3，CRYSTAL)；恒温震荡培养箱(IS-RDVL，CRYSTAL)；显微镜(AB210-T，Motic)；冷冻干燥仪(HETOLL1500，捷克)；离心机(Centrifuge-5424，Eppendorf)；PCR扩增仪(TC-4000，TECHNE)；凝胶成像仪(1600R，Tanon)；电泳仪(Powerpac-HV，BIO-RAD).

1.2 方法

1.2.1 菌株活化 从牛奶管中挑取实验菌株，用MA10培养基平板划线，28 ℃培养7～10 d.如此活化2次，接种到MA10平板和斜面，备用.

1.2.2 淀粉酶活性筛选 采用平板水解圈法(Plate Hydrolysis Sport Method)[12]进行.取活化好的实验菌株，采用点接法在淀粉水解培养基平板上接种，每个平板接种4株菌.28 ℃培养7 d，观察记录菌株生长情况.在平板上倒卢哥氏碘液至淹没培养基表面，染色2～3 min，弃碘液.若菌落周围出现无色透明水解圈，表示淀粉水解酶呈阳性.透明水解圈直径越大，表示菌株产淀粉酶活性越强.

1.2.3 系统发育多样性分析 细菌基因组DNA酶法提取和16S rRNA基因PCR扩增按文献[13]所用方法操作.PCR产物由上海生工进行测序，所得序列上传NCBI(National Center for Biotechnology Information)网站(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)的GenBank等序列公共数据库供共享，并获得序列号(Accession Number).在韩国分类公共数据网站EzBioCloud(http:∥www.ezbiocloud.net/identify)用Blast搜索程序进行相似性搜索[14]，调取同源性高的序列建立序列集.相似性(Sequence Similarity)计算和多重序列比对用CLUSTAL_X软件[15]进行，系统进化距离用Kimura模型[16]估算，聚类分析和系统进化树的构建运用MEGA 6.0软件包中的邻接(Neighbor-Joining)[17]法进行，重复1 000次估算进化树拓扑结构的稳定性[18].

1.2.4 生物学特性观察 参照文献[12]中的方法，以MA10为基础培养基，对部分产淀粉酶能力较强的菌株进行菌落特征、显微特征、生长条件和生理生化特征等基本生物学特征进行观察.

2 结果分析

2.1 淀粉酶活性筛选

根据平板水解圈法，对分离自张家口天漠沙土的76株嗜盐和耐盐菌进行了淀粉水解酶活性筛选，共得到淀粉酶活性菌株34株(表1)，阳性率44.7%.

表1 天漠沙土嗜盐和耐盐菌淀粉酶活性筛选结果

在以上阳性菌株中，发现有6株(JSM 1684012，JSM 1684041，JSM 1684067，JSM 1685081，JSM 1685082，JSM 1685098)产淀粉酶活性较强，其淀粉水解圈直径大于或等于50 mm，具有进一步研究的价值(表2).

表2 天漠沙土嗜盐和耐盐菌中淀粉酶活性较强菌株水解圈直径

2.2 基于16S rRNA基因序列的系统发育分析

对34株淀粉酶阳性菌进行基因组DNA提取、16S rRNA基因的PCR扩增和序列测定，所得序列提交GeneBank注册并获取相对应的序列号.基于16S rRNA基因序列的系统发育分析结果表明，这34株淀粉酶产生菌类群多样性和物种多样性较高，可以归为18个物种，分属于细菌域(Bacteria)的2门(Actinobacteria，Firmicutes)2科(Streptomycetaceae，Bacillaceae)8属(Streptomyces，Bacillus，Gracilibacillus，Halobacillus，Oceanobacillus，Piscibacillus，Thalassobacillus，Virgibacillus)(表3).

表3 天漠沙土嗜盐和耐盐菌淀粉酶活性阳性菌与其系统发育关系最密切的典型菌株

注：*产淀粉酶活性较强菌株.

系统发育分析结果表明，淀粉酶活性较强的6株菌都属于厚壁菌门(Firmicutes)芽孢杆菌科(Bacillaceae)，分属于该科的3个属(Bacillus，Gracilibacillus，Halobacillus).其中JSM 1684012，JSM 1684041和JSM 1685098属于芽孢杆菌属(Bacillus)，JSM 1684067和JSM 1685082属于纤长芽孢杆菌属(Gracilibacillus)，JSM 1685081属于喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)(表3，图1).

图1 根据16S rRNA基因序列构建的6株较强淀粉酶产生菌的系统发育树Fig. 1 Phylogenetic Tree of 6 Strains Strong in Starch Hydrolysis Based on 16S rRNA Gene Sequence Analysis

2.3 较强淀粉酶活性菌株的生物学特征

对6株淀粉酶活性较强菌株的菌落特征、显微形态、生长条件和部分生理生化特征进行观察，结果见表4.

表4 分离自天漠沙土的6株淀粉酶活性较强的嗜盐和耐盐菌的部分生物学特征

注:+阳性;-阴性；所有菌株H2S产生和酪素及纤维素水解呈阴性.

3 讨论

淀粉酶活性筛选表明，分离自河北省张家口市天漠沙土的76株嗜盐和耐盐菌中具有较高比例的淀粉酶活性菌株，共34株，阳性率44.7%.其中6株(JSM 1684012，JSM 1684041，JSM 1684067，JSM 1685081，JSM 1685082，JSM 1685098)显示出较高的淀粉酶活性.基于16S rRNA基因序列的系统发育分析结果表明，这34株淀粉酶阳性菌株具有较高的类群多样性和物种多样性，可以归为18个物种，分属于细菌域(Bacteria)2门(Actinobacteria，Firmicutes)2科(Streptomycetaceae，Bacillaceae)8属(Streptomyces，Bacillus，Gracilibacillus，Halobacillus，Oceanobacillus，Piscibacillus，Thalassobacillus，Virgibacillus).根据有关报道，目前生产与应用的淀粉酶产生菌大部分属于芽孢杆菌属(Bacillus)[19]、栖热菌属(Thermus)[20]和噬纤维菌属(Cytophaga)[21-22]等.本研究发现的产淀粉酶菌株除了常见的芽孢杆菌属(Bacillus)外，还包括更广泛的细菌类群(Streptomyces，Gracilibacillus，Halobacillus，Oceanobacillus，Piscibacillus，Thalassobacillus，Virgibacillus)，说明嗜盐和耐盐菌中有较多的类群能产生淀粉酶.