入侵植物黄顶菊内生细菌对苹果轮纹病菌的拮抗筛选

侯晓杰，梁魁景，欧阳汝欣，芦站根

(衡水学院生命科学系，河北 衡水 053000)

近年来苹果轮纹病的危害日趋严重，发生频率大幅增加，严重影响了我国苹果品质和产量，使果农遭受巨大经济损失。我国华北、华东、东北等地苹果轮纹病发生严重，国光、富士、金冠、红月等都是易感品种[1]。目前，植物内生菌在病虫害生物防治方面已经应用，植物内生真菌、细菌、放线菌防治植物病害效果显著。例如，利用大豆根瘤内生细菌防治棉花枯萎病[2]，桃树根部内生细菌防治桃褐腐病[3]，剑麻内生细菌JM-3防治苹果腐烂病[4]，姜、蒜内生菌防治苹果轮纹病[5]等。

衡水湖的外来入侵植物黄顶菊Flaveriabidentis，根茎发达，适应性强，具较强的化感作用。黄顶菊入侵性如此强大，在其体内的内生菌与它互利共生，所以肯定具有协同作用[6]。菌株本身或分泌物具有抑制其他植物生长的化学物质。本研究以衡水湖外来入侵植物黄顶菊为材料，研究其组织内可培养内生菌对于苹果轮纹病病菌Botryosphaeriadothidea是否有拮抗作用[7]，期望找出能够抑制苹果轮纹病病菌生长的菌株。

1 材料与方法

1.1 材料 黄顶菊，2015年10月6日采于衡水湖国家湿地公园，1 a生完整植株。苹果轮纹病病菌，来源于衡水学院生命科学系园林植物学实验室。

1.2 方法

1.2.1 内生细菌的分离、纯化 用自来水冲洗黄顶菊3 min，去除植株表面附着的泥沙，室内晾干。分别取根、茎、叶、花各5 g，无菌水清洗干净，置于75%酒精溶液中浸泡30 s，转至3.125%次氯酸钠溶液中浸泡6 min，无菌水清洗5次。将各部分组织分别剪碎放入研钵中，加入10 mL无菌水，充分研磨，静置备用。分别吸取50，100，150 μL研磨液，涂抹于NA平板上，每组织重复3次，28 ℃培养2～3 d。待菌落长出后，观察记录菌落形态、边缘光滑度、大小、颜色，挑取单菌落划线纯化，4 ℃保存。

1.2.2 内生细菌对苹果轮纹病病菌的对峙培养 注入2 mL无菌水至纯化的内生菌培养皿内，玻璃刮棒轻轻刮取平板上的细菌，用移液器吸取浑浊液转至三角瓶，密封瓶口后震荡1min使液体混合均匀。用722分光光度计调整细菌悬浊液浓度，使其波长665 nm下的OD值为1.000，密封口备用。用直径1 cm的打孔器在复壮后的苹果轮纹病培养基上打孔，挑取菌饼倒扣接种在新的PDA平板上。以菌饼为中心，周围均匀放置3个直径1 cm的圆形灭菌滤纸片，滤纸片中心距培养皿边缘约1.5 cm，每滤纸片分别接种50 μL细菌悬浊液，每种细菌重复3次。对照为无菌水。PDA平板置于28 ℃恒温培养4～5 d。

1.3 数据处理 用Excel软件处理数据及作图，用SPSS 17.0进行方差分析，差异显著性水平为5%(P<0.05)。

抑菌率(%)=(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100

2 结果与分析

2.1 内生细菌的分离 由于分离培养时吸取的100，150 μL研磨液的NA平板上菌落密度过大，无法辨别单个菌落的特征，所以只对50 μL研磨液平板上的菌株进行筛选。通过观察，黄顶菊植株内共分离到14株菌株(表1)，其中根、茎、叶组织各分离到4株，花组织分离到2株。根、茎、叶器官的分离比率较高。

表1 黄顶菊组织可培养内生菌的分离结果

2.2 对峙培养 除根3菌株外其余13株菌株都对苹果轮纹病菌丝有抑制效果。菌株茎1、茎2、茎4、花1、花2抑菌效果与对照比较具有显著性差异，但这5菌株之间抑制效果差异性不显著。抑菌效果最好的茎4菌株，其真菌菌落直径为(39.96±2.66) mm，抑菌率为33.21%(表2)。

表2 黄顶菊组织内可培养内生细菌对苹果轮纹病病菌的菌丝生长抑制结果

注:表中同列标有不同字母表示组间差异显著(P<0.05)。

3 结论与讨论

黄顶菊植株各组织器官均能分离到可培养内生细菌，且大部分菌株对苹果轮纹病菌丝生长具有抑制效果，其中茎、花组织内生细菌的抑菌效果较好，抑菌率最高达33.21%，说明黄顶菊内生细菌是潜在的生防菌资源，可为进一步筛选苹果轮纹病的生防制剂奠定基础。根3菌株的抑菌率为-1.34%，说明该菌株对苹果轮纹病菌丝生长不但无效还起到了刺激其生长的作用，后续实验有待验证。

目前，黄顶菊的研究主要集中在生理、生态、基础防除及生物活性和化学成份等方面[8-11]，其生物成份和化学成份具有抗菌、杀虫活性[12]。本文对于黄顶菊内生菌的研究将为外来入侵杂草研究提供新的方向。另外，黄顶菊组织内不可培养内生细菌是否存在，以及是否对苹果轮纹病菌具有拮抗效果有待进一步研究。

苹果轮纹病已成为我国苹果产业健康发展的重要制约因子之一。生物防治作为新时期病害防治的研究热点，在苹果轮纹病的防治上由于受到技术、经济等原因并未大规模投入生产。因此，黄顶菊内生菌对苹果轮纹病的拮抗筛选研究可成为筛选经济、高效生防制剂的一部分，具有广阔的市场前景。