羧甲基化改性制备 高保水、软凝胶型卡拉胶

刘晓婷,安凤平,王艺伟,黄 群,滕 慧,宋洪波

(福建农林大学食品科学学院,福建福州 350002)

卡拉胶是提取自红藻的水溶性胶体,其中κ-卡拉胶是目前应用最为广泛的一种卡拉胶,具有独特的热可逆凝胶性质和抗蛋白凝结性等特点[1-2],在食品工业、化学工业、包装行业、制药等领域已经广泛应用[3-4]。

传统方法加工的κ-卡拉胶,特别是高强度卡拉胶在实际应用中胶体易收缩,具有泌水性、保水性能差的缺点,其应用受到限制。近年来、高保水、软凝胶等特种胶体的市场需求量越来越大,其中高保水、软凝胶兼备的胶体因具有更好的持水稳定性及柔和的凝胶特性,可赋予产品稳定的组织形态及软弹性特征,因此在乳制品、饮料、肉制品等食品加工领域以及精细化工、生物医药中有良好的应用前景[5-7]。目前,软凝胶的研究主要集中在ι-卡拉胶[6-7];有研究表明,制备κ-卡拉胶过程中,在煮胶工序加入胶联系剂以改善胶体的保水性[8]。通常,根据市场需求的软凝胶胶体的凝胶强度应小于300 g/cm2,高保水胶体的析水率不大于0.5%,优质软凝胶胶体应具备较低的凝胶强度和小的析水率。目前关于以κ-卡拉胶为原料,改性制备高保水、软凝胶型卡拉胶的研究尚未见报道。

本文研究羧甲基化反应改性κ-卡拉胶,使卡拉胶中的羟基被羧甲基取代,以低析水率为主要目标,同时兼顾较低的凝胶强度,对反应条件进行优化;运用红外光谱扫描、核磁共振探讨改性机理,为高保水、软凝胶型卡拉胶的加工提供理论和方法依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

κ-卡拉胶 福建绿新食品有限公司;无水乙醇、氢氧化钠、氯化钾、醋酸 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;氯乙酸 分析纯,天津风船化学试剂有限公司。

DS32-ⅢB型双螺杆挤压机 济南赛信机械有限公司;HH-6型恒温水浴锅 金坛市双捷试验仪器厂;101-0型鼓风干燥机 上海阳光试验仪器有限公司;FZl02型微型植物粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司;NG1型指针型凝胶强度测定仪 中国科学院海洋研究所;BS124S型电子分析天平、TE612-L型电子天平、PB-10pH计 赛多利斯科学仪器有限公司;FTIR-8400S型傅立叶变换红外光谱仪 日本岛津公司;ADVANCE III HD 400M型核磁共振仪 瑞士布鲁克公司。

1.2 实验方法

1.2.1 改性卡拉胶的制备 采用螺杆挤压机预处理κ-卡拉胶粉,螺杆挤压处理工艺条件为:水料比2.0∶5 mL/g、温度75 ℃、螺杆转速100 r/min;40 ℃恒温干燥24 h,粉碎后过80目筛,得预处理卡拉胶粉。

取10.00 g预处理卡拉胶粉,加入100 mL一定浓度的乙醇溶液并搅拌使卡拉胶均匀分散,分别加入4 mL浓度为20%(w/w)氢氧化钠溶液至反应体系中，使氢氧化钠浓度为0.8%,于35 ℃水浴保温1 h;滴加一定量的氯乙酸钠溶液(由氯乙酸与等摩尔比的20%氢氧化钠水溶液中和制备得到),按一定的温度反应3 h后,冷却至室温;用1 mol/L醋酸调节pH至7.0,抽滤后用相应浓度的乙醇溶液洗涤滤饼3次,收集滤饼,40 ℃恒温干燥24 h,粉碎过80目筛得改性卡拉胶粉末[8]。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 氯乙酸钠添加量对改性效果的影响 固定羧甲基化反应温度45 ℃、乙醇浓度60%,按照氯乙酸钠添加量分别为0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030 mol进行实验,考察氯乙酸钠添加量对卡拉胶析水率和凝胶强度的影响。

1.2.2.2 羧甲基化反应温度对改性效果的影响 固定氯乙酸钠添加量0.01 mol、乙醇浓度60%,反应温度分别为40、45、50、55、60、65 ℃,考察羧甲基化反应温度对卡拉胶析水率和凝胶强度的影响。

1.2.2.3 乙醇浓度对改性效果的影响 固定氯乙酸钠添加量0.01 mol、羧甲基化反应温度45 ℃,考察乙醇浓度分别为50%、60%、70%、80%、90%对卡拉胶析水率和凝胶强度的影响。

1.2.3 响应面优化试验 根据单因素试验结果,以析水率为主要考察指标、凝胶强度为辅助考察指标,选取氯乙酸钠添加量(A)、羧甲基化反应温度(B)、乙醇浓度(C)3个因素为自变量,析水率(Y1)、凝胶强度(Y2)为响应值,设计响应面试验,因素水平如表1所示。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levelsTable of response surface experiment

1.2.4 析水率及凝胶强度的测定 将3.00 g改性卡拉胶粉末加入到250 mL烧杯中,量取4 mL 10% KCl溶液,混合均匀,再添加200 mL蒸馏水,95 ℃水浴加热1.5 h,分成三份装在30 mL塑料量杯中,盖上盖子,待冷却后于恒温箱中放置14 h,对制备得到的改性卡拉胶凝胶测定析水率及凝胶强度,平行3次取平均值[4,9-10]。

析水率的测定:精确称取1.2.4中得到的一定质量卡拉胶凝胶,用滤纸吸干凝胶表面水珠后再次进行精确称重,析水率按公式(1)计算:

K(%)=[(m1-m2)/m1]×100

式(1)

式中:K:试样的析水率(1.5%改性卡拉胶溶液的凝胶,20 ℃),%;m1:初始凝胶质量,g;m2:除去表面水珠后的凝胶质量,g。

凝胶强度的测定:将1.2.4中制得的改性卡拉胶凝胶样品置于凝胶强度测定仪的试样座上,首先记录表盘的初始数值,打开开关,记录凝胶瞬间破裂时表盘的数值,两个数值之差即为凝胶强度[4]。凝胶强度计算如式(2):

P=G×f

式(2)

式中:P:试样的凝胶强度(1.5%溶液的凝胶,20 ℃),g/cm2;G:测定的凝胶强度值,g/cm2;f:温度校正系数,根据GB 1975-2010,30 ℃环境下的温度校正系数为1.35。

1.2.5 红外光谱 将干燥的卡拉胶样品与溴化钾按照1∶100～1∶150比例混合,充分研磨后,倒入仪器的模具中抽真空压片,于12 MPa保持30 s,直到压片呈现透明。傅立叶变换红外光谱扫描仪扫描范围为4500～500 cm-1,分辨率为4 cm-1,扫描次数16～32[11]。

1.2.6 核磁共振 将干燥的卡拉胶充分研磨后装入样品管中,采用Brucker DPX-400M型固体核磁共振仪对样品进行13C-NMR谱测定。

1.3 数据处理与分析

采用Design-Expert V8.0.6及DPS 7.0统计分析软件对数据进行处理,采用Microsoft Excel 2007及Origin 8.0作图。

2 结果与分析

2.1 改性工艺条件优化结果分析

2.1.1 单因素试验

2.1.1.1 氯乙酸钠添加量对改性效果的影响 由图1可知,在氯乙酸钠添加量为0.005～0.030 mol范围内,随着氯乙酸钠添加量的增多,改性卡拉胶的析水率和凝胶强度均持续减小。这是因为,随着氯乙酸钠添加量增多,羧甲基化卡拉胶生成量亦随之增多,因此析水率及凝胶强度均随之降低。考虑到氯乙酸添加量对析水率和凝胶强度具有明显影响,因此确定氯乙酸钠添加量0.020～0.030 mol作为优化试验的范围。

图1 氯乙酸钠添加量对析水率和凝胶强度的影响Fig.1 Effect of sodium chloroacetate addition on separating water rate and gel strength注:图中字母不同表示组间差异显著(p<0.05),下同。

2.1.1.2 羧甲基化反应温度对改性效果的影响 由图2可知,随着羧甲基化反应温度的升高,改性卡拉胶的析水率和凝胶强度逐渐减小。是因为反应温度的升高有利于增大氯乙酸钠向胶体内部扩散的速率,从而加快羧甲基化反应速率[12];综合考虑,确定羧甲基化反应温度55～65 ℃为优化试验范围。

图2 羧甲基化反应温度对析水率和凝胶强度的影响Fig.2 Effect of carboxymethylation temperature on separating water rate and gel strength

2.1.1.3 乙醇浓度对改性效果的影响 由图3可知,随着乙醇浓度的增加,改性卡拉胶的析水率和凝胶强度均随之显著减小(p<0.05);至80%以后,析水率减小的趋势有所变缓。由于乙醇具备较大极性,对羧甲基化反应进行起到一定的促进作用[13],因此增大乙醇浓度,产物的析水率和凝胶强度均会减小;此外,由于H2O分子对卡拉胶具有溶胀作用,有助于将反应物小分子输送到卡拉胶内部,促使反应进行,因而适量的水分是必须的。确定乙醇浓度60%～80%为优化的参数范围。

图3 乙醇浓度对析水率和凝胶强度的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on separating water rate and gel strength

2.1.2 响应面优化试验

2.1.2.1 响应模型建立与分析 对表2中析水率(Y1)与氯乙酸钠添加量(A)、羧甲基化反应温度(B)、乙醇浓度(C)的关系进行拟合,并根据表3的方差分析结果,剔除不显著项后得到二次多元回归方程:

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Design and results for response surface experiment

表3 析水率方差分析表Table 3 Variance analysis for separating water rate

Y1=0.25-0.024A-0.026B-0.18C+0.025AC+0.021BC-0.023A2-0.016B2-0.047C2

式(3)

由表3可知,对于析水率模型p<0.0001,模型极显著;而失拟项p=0.3251>0.05,不显著,表明该模型具有统计学意义,析水率模型的稳定性好。氯乙酸钠添加量、羧甲基化反应温度和乙醇浓度的一次项和二次项对析水率的影响均极显著(p<0.01);氯乙酸钠添加量和乙醇浓度的交互作用、羧甲基化反应温度和乙醇浓度的交互作用均极显著(p<0.01)。

同理,依据表2中凝胶强度以及表4中的显著性分析结果,可得凝胶强度与氯乙酸钠添加量、羧甲基化反应温度、乙醇浓度关系的二次多元回归方程为:

表4 凝胶强度方差分析表Table 4 Variance analysis for gel strength

Y2=263.74-22.02A-27.89B-225.77C+10.39AB+15.58AC+14.92BC-13.04A2-14.40B2+20.80C2

式(4)

由表4可知,凝胶强度模型的显著性检验p<0.0001,而失拟项p=0.1028>0.05,说明该模型具有统计学意义,且稳定性好。氯乙酸钠添加量、羧甲基化反应温度、乙醇浓度3个因素的一次项、二次项及两两因素间的交互作用均极显著(p<0.01)。

由F值的大小可知,对析水率和凝胶强度影响的主次顺序均为:C>B>A,即乙醇浓度>羧甲基化反应温度>氯乙酸钠添加量。

2.1.2.2 响应面分析 由图4可以看出,氯乙酸钠添加量和羧甲基化反应温度交互作用对析水率的影响不显著;氯乙酸钠添加量和乙醇浓度、以及羧甲基化反应温度和乙醇浓度的交互作用对析水率的影响显著。此结果与表3的显著性分析结果一致。

图4 两因素交互作用对析水率的影响Fig.4 Effects of cross-interaction of two factors on separating water rate

由图5可知,氯乙酸钠添加量和羧甲基化反应温度、氯乙酸钠添加量和乙醇浓度、以及羧甲基化反应温度和乙醇浓度交互作用对凝胶强度的影响均极显著,与表4的显著性分析结果一致。

图5 两因素交互作用对凝胶强度的影响Fig.5 Effects of cross-interaction of two factors on gel strength

2.1.2.3 最佳工艺条件确定及验证试验 由于改性卡拉胶的析水率越小,其凝胶强度亦越低,因此改性卡拉胶析水率并非越小越好。在保证析水率足够低的同时,还应具备一定的凝胶强度(≤300 g/cm2),满足软凝胶的特性。以低析水率为主、凝胶强度为辅,因此运用式(3)所示三个因素与析水率关系模型,以析水率为0.15%,兼顾较低的凝胶强度,确定的工艺参数为:氯乙酸钠添加量0.02 mol、羧甲基化反应温度65.13 ℃、乙醇浓度69.35%。考虑到实验可操作性，修正最佳条件为：氯乙酸添加量为0.02 mol、羧甲基化反应温度65 ℃、乙醇浓度69%，在此条件下,制备卡拉胶的析水率为0.16±0.001%、凝胶强度为(205±1.22) g/cm2,与模型(3)和(4)预测值0.158%、208 g/cm2的相对误差在1.5%以内。

经测定,未改性卡拉胶的析水率为4.60%±0.005%、凝胶强度为(2120±10.23) g/cm2。因此,改性卡拉胶的综合性能得到极大改善,总体表现出优秀的保水性能和软凝胶性能。

2.2 结果分析

2.2.1 红外光谱分析 图6为未改性κ-卡拉胶(KC)、改性卡拉胶(HRKC)的红外图谱,对于未改性κ-卡拉胶的红外图谱,其中3420 cm-1处吸收峰为-OH的伸缩振动吸收峰,2962 cm-1和2925 cm-1处吸收峰分别为甲基和亚甲基C-H键的伸缩振动吸收峰,1624 cm-1为糖的水化物的吸收峰,1260 cm-1表示硫酸基上O=S=O的伸缩振动峰,1159 cm-1处则为醚桥键的C-O-C特征峰,在1070 cm-1处是连接羟基的C-O-的伸缩振动吸收峰,928 cm-1位置是α-D-3,6内醚半乳糖上C-O-C的特征吸收峰,848 cm-1处为半乳糖C4-O-S的伸缩振动吸收峰[14-15]。

图6 未改性κ-卡拉胶(KC)、 改性卡拉胶(HRKC)的红外光谱图Fig.6 Infrared spectra of κ-carrageenan and modified carrageenan

与未改性的κ-卡拉胶红外图谱相比,改性卡拉胶在1624 cm-1处的吸收峰减弱,而1424 cm-1位置有了新的吸收峰,即羧甲基的-COO-的特征吸收峰;1327 cm-1处吸收峰的强度增加,表明连接羟基的C-O-键的数量增多了;3420 cm-1处的吸收峰强度有所减弱,表明在羟基相连接的位点发生了取代。由此表明,改性卡拉胶的糖单元结构中有羧甲基官能团引入;其它吸收峰未改变,说明卡拉胶的糖单元结构没有被破坏。

图7 未改性κ-卡拉胶核磁共振图Fig.7 13C-NMR spectra of κ-carrageenan

图8 改性卡拉胶核磁共振图谱Fig.8 13C-NMR spectra of modified carrageenan

3 结论

本实验对κ-卡拉胶进行螺杆挤压预处理后,再进行羧甲基化反应改性,优化了羧甲基化的反应条件,并结合红外光谱扫描及核磁共振对其改性机理进行了研究。结果表明:通过响应面法优化羧甲基化反应结合实际反应条件，修正后确定的优化条件为:氯乙酸钠添加量0.02 mol、羧甲基化反应温度65 ℃、乙醇浓度69%。在此条件下制备的改性卡拉胶的析水率为0.16%、凝胶强度为205 g/cm2,与未改性卡拉胶相比,析水率降低了96.5%,凝胶强度满足

软凝胶的要求。改性卡拉胶的糖单元结构中引入了羧甲基官能团,原有的结构未遭到破坏,因此析水率有效降低的同时,凝胶强度亦明显降低。