草莓酵素发酵过程中 氨基酸成分分析和蛋白质营养评价

陈小伟,程勇杰,范昊安,薛淑龙,蒋立新, 张 婷,王珍珍,毛旸晨,沙如意,*,毛建卫,*

(1.浙江科技学院生物与化学工程学院,浙江杭州 310023; 2.浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室,浙江杭州 310023; 3.浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心,浙江杭州 310023; 4.杭州医学院,浙江杭州 310053)

植物酵素是以一种或多种蔬菜、水果和豆谷类、海藻类、药食两用本草类、菌菇类植物等为原料,加(或不加)糖类物质,经加入单种或多种益生菌发酵(或不加菌依靠植物表面本身保留的微生物发酵),经过低温长时间发酵而产生的功能性微生物发酵产品[1-2]。草莓作为大众喜欢的水果,营养价值丰富,被誉为“水果皇后”[3],具有保健功能,兼有保护视力,助消化,防止便秘等功效[4]。其本身含有丰富的维生素C、多酚类、黄酮类、花青素等多种功能性成分[5]。

氨基酸是重要的生命物质,是组成生物体中酶和蛋白质的基本单元[6]。植物酵素中含有大量风味氨基酸和人体必需氨基酸,目前对于植物酵素蛋白质和氨基酸的研究主要包括蛋白质含量检测[7]、氨基酸分析与功能因子的相关性[8],因此对植物酵素进行氨基酸分析与蛋白质的营养成分评估极有必要[9]。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是中枢神经系统中重要的抑制性神经递质,GABA含量异常与人体多种神经和精神疾病,如帕金森综合症[10]、癫痫[11]、焦虑[12]等有关[13]。Ge等[14]研究发现GABA在成人大脑新生成的神经元突触融合中起重要作用,神经元活动调节成人神经发生,新的神经元有助于特定的脑功能。目前还未见关于植物酵素氨基酸和蛋白质营养评价的研究报道,本文对草莓酵素氨基酸和蛋白质营养评价的同时,还利用氨基酸味觉阈对草莓酵素的风味进行评估,确定发酵过程中各种风味氨基酸对味觉的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

草莓 采摘于杭州黄爷爷生态农业科技有限公司,选择八分熟的新鲜无病虫害,个体完整的草莓果实,个体重量为(23.00±6.00) g;发酵用糖浆和酵素菌液 由浙江省农副产品加工重点实验室提供,采用常温密闭,避光的自然发酵方式;考马斯亮蓝G250、重蒸酚 上海长哲生物科技有限公司;混合氨基酸标准溶液(含Asp、Glu、Met、Tyr、Phe等17种氨基酸)、GABA 色谱纯,日本和光纯业工业株式会社;柠檬酸钠(2H2O)、氢氧化钠、氯化钠、茚三酮 优级纯,国药集团化学试剂有限公司;丙二醇单甲基醚、无水醋酸钠、乙醇、冰醋酸 色谱纯,阿拉丁试剂有限公司;纯净水 娃哈哈集团。

KQ-300E型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;DZF-6020型真空干燥箱 上海迈源环境实验设备有限公司;PTX-FA210型电子天平 福州华志科学仪器有限公司;JT-DCY-12Y型水浴氮吹仪 杭州聚同电子有限公司;Allegra X-12R型离心机 贝克曼库尔特有限公司;L-8900型氨基酸分析仪 日本日立公司。

1.2 实验方法

1.2.1 草莓酵素的制备 采用程勇杰[8]等的方法。用灭菌好冷却后的无菌水轻洗草莓样品表面,常温下自然沥干。沥干后去蒂直接切成薄片,按草莓和糖液(w∶w=3∶4)30 kg快速加入高压蒸汽灭菌过的发酵罐,加入10%(v/v)的酵素菌液(菌体浓度:1×105CFU/mL),密闭、25 ℃室温避光发酵。实验3次平行。定时取一定量发酵液,在6000 r/min转速下离心15 min,取上层清液于-85 ℃超低温冰箱保存待测。样品发酵取样时间分别为10、20、30、50、75、110、140、155 d。

1.2.2 蛋白质含量测定 采用考马斯亮蓝G250法[15]测定发酵液中蛋白质含量。准确称取考马斯亮蓝G250试剂100 mg,溶于50 mL 95%乙醇,加入85%(w/v)磷酸,用水稀释至1000 mL备用,利用牛血清白蛋白制备标准曲线,线性方程y=0.0055x+0.064,R2=0.9994。实验前取出冷冻后的草莓酵素,与30 ℃水浴30 min,取200 μL草莓酵素,加水至1000 μL,然后加入5 mL配制好的考马斯亮蓝G250溶液,混匀,静置反应10 min,以去离子水做空白对照,在595 nm波长下测定吸光度,计算蛋白质含量。

1.2.3 样品前处理和氨基酸分析 用酸水解法进行样品处理[16]:取冷冻后于30 ℃水浴30 min后的草莓酵素1 mL于水解管中,加入HCl∶H2O=1∶1(v/v)的HCl溶液10 mL,重蒸酚175 μL,振荡混匀,在冰水浴中冷却5 min后吹入氮气保护,于110 ℃数显恒温鼓风干燥箱中水解22 h。水解液经冷却,过滤、冲洗、定容至50 mL容量瓶中。再取2 mL滤液,45 ℃真空干燥,完毕后,加入1 mL去离子水同条件再次烘干,加入1 mL 0.02 mol/L柠檬酸钠缓冲液,过0.22 μm微孔滤膜,等待上机进样。

氨基酸分析仪操作条件参照GB 5009.124-2016[17],流动相:柠檬酸钠缓冲溶液,控制流速:0.4 mL/min;进样量:20 μL;分离柱柱温:57 ℃;反应柱柱温:135 ℃;检测波长:脯氨酸检测波长440 nm,其它氨基酸检测波长570 nm。以峰面积作为检测结果,采用外标法计算氨基酸浓度。

1.2.4 氨基酸营养价值与风味评价 采用1973年FAO/WHO建议的氨基酸评分标准进行评价[18-20],评价范围包括氨基酸评分(Amino acid score,AAS)、氨基酸比值(ratio of amino acid,RAA)、氨基酸比值系数(ratio coefficient of amino acid,RC)、比值系数分(score of ratio coefficient of amino acid,SRC)。具体计算方法如下,

氨基酸得分(AAS)(%)=[某必需氨基酸含量(g/100 g粗蛋白)]/[FAO/WHO模式中该必需氨基酸含量(g/100 g粗蛋白)]×100

氨基酸比值(RAA)(%)=[某必需氨基酸含量(g/100 g粗蛋白)]/[模式中该必需氨基酸含量(g/100 g粗蛋白)]×100

SRC=100-CV×100

氨基酸风味成分按照氨基酸含量用味觉阀值比[21]来分析,评价指标为含量阀值比(ratio of content and taste threshold,RCT)。

1.3 数据处理

本实验对各个时间点不同参数进行测定,实验重复次数n=3,氨基酸含量取3次实验平均值,氨基酸组成评价与蛋白质营养评价以“平均值±标准偏差”表示。蛋白质、必需氨基酸和GABA含量变化采用Origin 8.6绘图,氨基酸聚类分析采用SPSS 18.0处理。

2 结果与分析

2.1 草莓酵素发酵过程中蛋白质含量变化

图1是不同发酵时间发酵液中可溶性蛋白质含量变化趋势,在发酵的前20 d,几乎检测不到蛋白质。在20～30 d,蛋白质含量迅速上升,在此时间范围内,充足的糖分和原料本身的营养物质,使微生物大量繁殖代谢生成蛋白质,同时原料中的蛋白质随着发酵的进行,也会浸渍到发酵液中。在30～75 d,蛋白含量呈缓慢增加的趋势,至75 d含量达到最高,为137.68 μg/mL,随后蛋白质含量有所下降,在第110 d降至103.03 μg/mL,然后再呈缓慢增加的趋势。袁周率等[7]通过对糙米酵素发酵前后糖类、蛋白质、氨基酸等研究发现,发酵前后可溶性糖从4.62%降至4.34%,蛋白质含量从0.51%升至0.58%。陈燕飞[22]指出,微生物在低渗透压食品中容易生长,在高渗透压下易于脱水死亡,只有少数酵母可耐受高渗透压环境。故发酵前期,微生物在高浓度糖浆造成极高的渗透压下难以生长繁殖,发酵液中可溶性蛋白质含量较少。随着反应时间的延长,草莓本身的水分渗出,充足的糖分和原料本身的营养物质,微生物开始快速利用丰富的碳源生长繁殖。蒋增良[23]通过研究树莓发酵过程中蛋白质的含量变化发现,发酵前64 d,蛋白质含量一直呈现上升趋势,在0～40 d增长了近两倍,增长速率最快。后期由于微生物对糖类物质的利用和次级代谢产物的积累导致部分微生物和细胞分解成小分子物质,蛋白质含量下降。110 d后,发酵液中的蛋白质含量轻微上升,可能是微生物对原料本身进行分解,导致原料蛋白质逐渐溶出或菌体自溶所致。

图1 不同发酵时间草莓酵素发酵液中的可溶性蛋白质含量Fig.1 Soluble protein content in strawberry jiaosu at different fermentation times

2.2 草莓酵素发酵过程中氨基酸含量变化

2.2.1 发酵过程中氨基酸组分变化 为考察自动氨基酸分析仪检测方法的线性关系,准确配制了浓度分别为2、5、20、50和100 nmol/mL的17种氨基酸和GABA混合标准溶液。图2为18种氨基酸(含GABA)的标准图谱,一通道(570 nm)下氨基酸在32 min内全部分离出,GABA出峰时间为21.55 min;二通道(440 nm)脯氨酸(Pro)在8 min前出峰完全。结果表明18种氨基酸分离效果良好。以峰面积为纵坐标,各种氨基酸浓度为自变量绘制标准曲线,线性关系良好,各相关系数均大于0.99,如表1所示。

图2 标准混合氨基酸图谱Fig.2 Chromatogram of standard amino acids

表1 氨基酸标准曲线Table 1 Standard curves of amino acids

采用外标法分析和计算不同发酵时间的草莓酵素样品中氨基酸含量,结果表明在发酵过程中检出的氨基酸包括天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、GABA、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)和脯氨酸(Pro),其中含量最高的2种氨基酸分别为Glu和Asp,而甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)和组氨酸(His)未检出。由于采用强酸对样品中的蛋白质和多肽水解时,水解过程中色氨酸(Trp)遭到破坏[24],因此在本方法下,草莓酵素中的Trp均未被检测到。

表2是草莓酵素发酵过程中各氨基酸组分含量变化情况,在发酵第10 d,发酵液中总氨基酸(不含GABA)含量较低,仅为0.288 mg/mL。发酵至10～30 d,总氨基酸含量迅速升至0.471 mg/mL。在发酵第30～140 d,总氨基酸含量呈总体平稳并缓慢增加。在草莓酵素发酵过程中,含量最高的2种氨基酸分别为Glu和Asp,发酵至第10 d,2种氨基酸的含量为0.101和0.105 mg/mL,分占总氨基酸含量的35.43%和36.65%,两者总和接近总氨基酸含量的3/4,而两种氨基酸在后续的发酵过程中含量无明显变化。在人体内,Glu可与血氨结合形成谷氨酰胺,有利于肝脏的解毒功能,同时也可活跃人体的脑组织代谢,而Asp可缓解骨骼和牙齿的损害。一般而言,在草莓酵素发酵过程中Cys含量较为稳定,而Tyr在发酵第30 d才被检测到,其它检测到的氨基酸均呈先上升,再趋于稳定的趋势。姜远茂[25]等对哈达和丰香等4种草莓的氨基酸含量分析,发现四种草莓中Asp和Glu含量均最高,这也与草莓酵素发酵过程中观察到的主要氨基酸结果相一致。石彦国[26]等也指出草莓原料中Asp含量高达176 mg/100 g,因此发酵液中的Glu、Asp可能与草莓原料本身的溶出有关。袁周率[7]通过对糙米酵素发酵前后氨基酸含量研究发现,发酵后部分氨基酸含量有所上升,其中Ala上升了17.74%。

表2 草莓酵素发酵过程中氨基酸含量变化(mg/mL)Table 2 Change of amino acid content in ferment of strawberry jiaosu(mg/mL)

2.2.2 发酵过程氨基酸种类特性的聚类分析 对草莓酵素不同发酵时间氨基酸的聚类分析结果如图3所示,其中1～8分别代表发酵时间为10、20、30、50、75、110、140和155 d。由图3可知,根据发酵时间,可将氨基酸聚类为四类。即第1类:10 d,第2类:20 d,第3类:30、50、75 d,第4类是110、140、155 d。聚类分析的结果代表着不同发酵时间,氨基酸含量从极低到缓慢增加,再到趋于稳定的总趋势,与利用氨基酸分析仪得到的不同发酵时间氨基酸变化趋势结果相一致。

图3 草莓酵素发酵过程中氨基酸变化时间特征聚类图Fig.3 Characteristic clustering of amino acid change in different fermentation times of strawberry jiaosu

2.2.3 草莓酵素发酵过程中GABA的变化 如图4所示,发酵前20 d,GABA含量明显上升,在发酵第20 d含量达到最高,为23.48 mg/L,随之,含量急剧下降,在发酵第50 d,浓度降到2.27 mg/L。随后又呈缓慢上升的趋势,发酵至155 d的含量与第10 d含量相接近。这有可能是发酵前期,在微生物分泌的蛋白酶作用下将蛋白质水解,造成游离氨基酸如Glu等增多,而微生物(如乳酸菌)分泌的Glu脱羧酶催化谷氨酸合成GABA导致其浓度增加[27]。

图4 发酵过程中GABA含量变化Fig.4 Changes in GABA content during fermentation

2.3 草莓酵素发酵过程中氨基酸营养评价

2.3.1 草莓酵素中必需氨基酸含量 如图5所示,在草莓酵素发酵过程中必需氨基酸含量不断上升,在发酵第10 d仅为0.024 mg/mL,发酵第30 d上升至第10 d的2倍。经过155 d的发酵,必需氨基酸含量上升至0.104 mg/mL,相比发酵第10 d提高了3.33倍。吕春茂等[28]发现苹果渣发酵后必需氨基酸含量从0.87 mg/mL增加到5.33 mg/mL,从某种意义上来讲,必需氨基酸含量与营养价值具有一定的相关性。

图5 草莓酵素发酵过程中必需氨基酸含量变化曲线Fig.5 Changes of the essential amino acid content in the fermentation process of strawberry jiaosu

2.3.2 草莓酵素中必需氨基酸组成评价 对于营养价值较高的蛋白质,首先要求必需氨基酸种类齐全,其次氨基酸之间的比例也同样重要。合适的比例才能与人体需求相符合,必需氨基酸吸收更完全,营养价值更高[29]。将草莓发酵液中必需氨基酸与FAO/WHO模式氨基酸谱进行对比,从而得出氨基酸得分,结果见表3。

表3 草莓酵素中必需氨基酸组成评价Table 3 Composition evaluation of essential amino acid in strawberry jiaosu

其中AAS值越接近于1,蛋白质营养价值越高;AAS值小于1或大于1,分别表示为蛋白质营养不足或营养过剩[30]。

由于在发酵的前20 d,蛋白质含量较低,低于考马斯亮蓝法检测蛋白质的浓度极限,因此未对发酵10 d和20 d的发酵液进行营养评估。发酵第30 d后,除Met外,其它8种必需氨基酸评分均>1,属于较为严重的营养过剩,特别是Thr和Cys。在草莓酵素发酵过程中总氨基酸含量增加(如表2),总蛋白质含量却相对稳定(如图1),同时必需氨基酸所占总氨基酸比例增加,导致各种氨基酸得分相应地增加。

2.3.3 草莓酵素蛋白质的营养评价 氨基酸比值[31]定义为一定量食物中氨基酸的含量相当于模式氨基酸的倍数。RC用于判定限制氨基酸和计算限制氨基酸的强化量,可用模式氨基酸相当量的一份样品中氨基酸的比值来表示。如果样品中氨基酸的组成与模式氨基酸模式相等,则RC等于1,同理,当RC>1,则表示相应氨基酸相对过剩,RC<1时表示相应氨基酸相对不足。SRC主要用于蛋白质营养价值的评价。理论上,SRC值越接近于100,蛋白质的营养价值越高。

对不同发酵时间草莓酵素RAA、RC和SRC进行计算,结果如表4所示,第一限制氨基酸为酪氨酸(Tyr)+苯丙氨酸(Phe)。发酵30 d后,SRC值均高于55,尤其是发酵50 d后,在稳定的微环境和较为稳定的菌种活性条件下下,SRC值呈逐渐增加的趋势。在整个发酵过程蛋白质营养价值由高到低依次是:155 d>140 d>110 d>30 d>75 d>50 d,这一结果与氨基酸聚类分析的第3类和第4类相一致。

表4 草莓酵素蛋白质的营养评价Table 4 Nutritional evaluation of proteins of strawberry jiaosu

2.3.4 氨基酸风味成分分析 天然氨基酸主要为L构型,而众多的L型氨基酸是食品中新鲜口感的主要贡献成分,如谷氨酸盐作为食品调味剂已被人们使用多年。在草莓酵素发酵过程中,分解产生的氨基酸和本身的游离氨基酸是影响草莓酵素风味的主要因素。依据氨基酸的味觉强度,大致可将氨基酸分为鲜味氨基酸(Asp、Glu、Lys)、甜味氨基酸(Thr、Ser、Gly、Ala、His、Pro)、苦味氨基酸(Val、Met、Ile、Leu、Arg)和芳香族氨基酸(Cys、Tyr、Phe)[19]。

表5为草莓酵素4种不同风味氨基酸在发酵过程中含量的变化趋势,随着发酵时间的延长,鲜味氨基酸含量趋于稳定;甜味氨基酸、芳香族氨基酸和苦味氨基酸含量不断升高。尤其是苦味氨基酸,在发酵后期其含量是其它风味氨基酸的几十甚至上百倍。忽略在草莓酵素发酵过程中添加的糖类物质对风味的影响,单纯从氨基酸含量上来看,在发酵前期,影响草莓酵素风味的物质为鲜味氨基酸和苦味氨基酸;在发酵后期,主要是苦味氨基酸占据绝对优势。

表5 发酵过程中不同风味氨基酸含量Table 5 Contents of different flavors of amino acids during fermentation

然而风味氨基酸的含量与对酵素风味贡献并不一定呈严格的正相关性,这主要是由于不同氨基酸的味觉阀值不同,氨基酸浓度与味觉阀值的对比称为RCT[32]。RCT<1,氨基酸对风味无贡献;只有当RCT≥1时,氨基酸才对风味有贡献。且RCT值越大,相应氨基酸对食品的风味贡献越大。表6计算了草莓酵素在发酵过程中各种风味氨基酸的含量阀值比,在发酵过程中,除Asp和Glu两种鲜味氨基酸的RCT值大于1,其它15种氨基酸对发酵液的风味均无明显的贡献,说明Asp和Glu两种氨基酸对草莓酵素发酵液的风味有主要贡献。然而在发酵过程中,Asp和Glu的含量变化趋势并不明显,而且由表2可知2种氨基酸的含量在整个发酵过程中变化也不明显。因此,从氨基酸角度讲,随着发酵时间的延长,草莓酵素的苦味、甜味、芳香等风味变化不明显,主要还是以鲜味为主要风味。当然,原料成分、微生物代谢产物的影响也可能会造成草莓酵素发酵液口感的变化。

表6 草莓酵素中各种风味氨基酸的含量阀值比(RCT)Table 6 Threshold content ratio of each flavor amino acid in strawberry jiaosu(RCT)

3 结论

对草莓酵素蛋白质和氨基酸含量及营养价值进行分析,结果表明,蛋白质含量在发酵前期明显增加,发酵至75 d含量达到最高,为137.68 μg/mL,随后缓慢降低,但相比发酵前有显著提升(p<0.05)。总氨基酸含量与必需氨基酸含量也有较明显提高,说明一定时间的发酵能提高酵素中蛋白质和氨基酸的含量,且提高程度较明显。GABA含量在发酵前20 d经过急剧变化后,再经过一定时间的发酵,GABA含量与发酵前并无明显差异,说明发酵对GABA的消耗再后期可以得到弥补。草莓酵素中氨基酸较为齐全,营养丰富,在整个发酵过程中,SRC值始终高于55,且数值处于上升趋势。由此可见,适当的延长发酵时间可有效提高草莓酵素的营养均衡度。就氨基酸呈味发酵过程中只有Asp和Glu两种鲜味氨基酸的RCT值大于1,对味觉有影响,但由于其它成分如有机酸和其它活性物质的影响,发酵过程中氨基酸含量的变化对味觉的影响不大。