国内外红茶菌研究进展

梅瀚杰,胡文锋

(华南农业大学食品学院,广东广州 510642)

红茶菌是一种传统的民间发酵饮料,它的出现最早可以追溯到我国古代的秦汉时期,但关于红茶菌的确切起源却无从得知。相传其最早出现在公元前220年我国的东北部地区,并且在公元414年传入日本[1]。不仅在中国、韩国等东南亚地区,在欧洲中部和东部各国也有许多关于红茶菌相关资料的流传,各地的人们对红茶菌有不同的叫法,在欧洲一些地方的人们把其称之为酸茶酒,并将其当作清凉饮料来缓解消化不良和动脉硬化等症状[2]。

但究其本质,红茶菌大多是以加入蔗糖的红茶作为底物,进行微生物发酵而制成的。红茶菌的母液中含有一部分的茶叶浸出物和发酵微生物及其代谢产物,包括:茶多酚、咖啡因、葡萄糖酸、乙酸、氨基酸、维生素、乙醇等。红茶菌是一种对人体有多种保健功效的饮料,但由于人们对微生物的认知不足,在酿造过程中极容易污染杂菌,使得红茶菌地位一直不高,但随着纯种培养、微生物分离等生物技术的进步,人们重新开始了对红茶菌的研究。近年来我国对红茶菌的研究大多都停留在对其成分的分析和抑菌功效的研究,但对红茶菌的具体作用机理和生理生化作用研究仍然寥寥无几。

国外对红茶菌的研究大约始于20世纪初。从20世纪中期开始,许多关于红茶菌对各种疾病的效果和作用已经有报道,有关红茶菌的微生物组成及相互作用、发酵条件的优化、菌液成分分析、功能因子作用机理等方面的研究也陆续有报道。本文将从菌种组成、红茶菌及细菌纤维工艺及应用和红茶菌的益生功效进行阐述。

1 红茶菌的菌种组成

红茶菌是由醋酸菌和酵母菌混合发酵而成,个别的红茶菌中也会添加一些乳酸菌。目前人们从红茶菌中分离得到的醋酸菌有:萨克塔堤查仁杆菌(Tanticharoeniasakaeratensis)、罗旺醋酸杆菌(Acetobacterlovaniensis)、过氧化醋酸杆菌(Acetobacterperoxydans)、蒲桃醋酸杆菌(Acetobactersyzygii)、冲绳醋酸杆菌(Acetobacterokinawensis)、热带醋酸杆菌(Acetobactertropicalis)、醋化醋杆菌(Acetobacterliquefyaciens)、重氮营养醋杆菌(Acetobacterdiazotrophicus)、甲醇醋杆菌(Acetobactermethanolica)、蜡状葡糖杆菌(Gluconobactercerinus)、氧化葡糖杆(Gluconobacteroxydans)、液化葡糖醋杆菌(Gluconacetobacterliquefaciens)、木葡糖醋杆菌(Gluconacetobacterxylinus)、温驯葡糖醋菌(Gluconacetobacteroboediens)、糖精葡糖醋杆菌(Gluconacetobactersaccharivorans)、中间葡糖醋杆菌(Gluconacetobacterintermedius)、雷提库斯葡糖醋杆菌(Gluconacetobacterrhaeticus)、汉逊德葡糖醋杆菌(Gluconacetobacterhansenii)。也有从红茶菌的优势菌群中分离到驹形杆菌属(Komagataeibacterspp.)的报道[3]。

从红茶菌中分离到的酵母菌包括:小捕有胞圆酵母(Torulasporamicroellipsoides)、博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)、克鲁丝假丝酵母(CandiadaKrusei)、近平滑假丝酵母(CandidaParapsilosis)、葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、栗酒裂殖酵母(SchizosaccharomycespombeLinder)、异常毕赤酵母(Pichiaanomala)、膜醭毕赤酵母(Pichiamembranifaciens)、弗洛接合有孢圆酵母(Zygotorulasporaflorentina)、拜尔接合有孢圆酵母(Zygotorulasporabailli)、法尔皮有孢汉生酵母(Hanseniasporavalbyensis)、异常德克酵母(Dekkeraanomala)、布鲁塞尔德克酵母(Dekkerabruxellensis)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)[4]。

各种红茶菌发酵所用的菌种组成各不相同,一般都是由好几种的醋酸菌与酵母菌共同发酵而成,少量红茶菌中会加入一种或几种乳酸菌。不同的菌种组成其发酵形成的母液当中的各成分含量也略有差别。在红茶菌的发酵液中醋酸菌和酵母菌为共生关系,在发酵初期,酵母分解蔗糖为自身提供碳源,同时酵母也可以把分解蔗糖得到的果糖和葡萄糖进一步转化为乙醇,为醋酸菌提供碳源和进一步氧化成乙酸的底物[4]。

2 红茶菌及其细菌纤维相关研究进展

2.1 红茶菌的制作工艺优化

目前国内大多数对红茶菌饮料的研究都还只局限于摇瓶实验,当在大型发酵罐中进行发酵的时候这些条件是否合适尚需商榷,并且国内针对发酵罐发酵各种参数优化的研究较少。任亮[30]在摇瓶实验中确定了部分工艺条件后,对5 L发酵罐发酵工艺条件中的搅拌速度进行了优化,对红茶菌的澄清条件和用喷雾干燥法制备红茶菌粉剂的工艺参数进行了优化。Ahmad等[31]通过对能耗与开销进行衡算,对4.5 L的自制发酵设备所发酵的红茶菌进行了工艺条件优化。任二芳[32]研究了利用固定化共生发酵来制作红茶菌饮料,在此基础上对饮料制作工艺上的部分参数和固定化载体的选用和制备条件进行了优化。目前这些研究尚属少数,且没有涉及到一些产业化所需的相关发酵技术的优化,如高密度发酵和连续发酵所需的一些条件并无报道。

对红茶菌的研究大多都是以其作为饮料的前提进行的,同时对其各项理化指标进行测试,少有将其作为一种非饮料食品进行工艺研究。孙永康等[33]则用红茶菌和葡萄酒酵母对红茶糖水进行发酵,研发一种红茶菌酒并对一些工艺条件进行了优化。高烨等[34]将红茶菌液掺入面团中,制成红茶菌面包同时优化了工艺参数。梁进等[35]在熬糖的过程中加入红茶菌液,制成具有红茶菌液风味的芝麻酥并优化了其中的工艺条件。虽然往食品中添加红茶菌使之成为一种红茶菌风味食品是一种好的尝试,但这些尝试中忽略了食品加工条件对红茶菌内各种功能因子的影响,如高温、酶或其他基团的影响而使部分功能因子变性或失活,在完成成品后除了感官评定外还应检测其中各功能因子含量变化,从而确定最优工艺条件。

2.2 红茶菌细菌纤维的制作工艺优化

红茶菌除了其母液的益生功效外,由其细菌发酵产生的一种细菌纤维近年来也开始备受关注。它是一种由细菌分泌到胞外的纤维素成分,醋酸菌为主要产生菌种,其中以木醋杆菌的产量较为突出。与普通植物纤维相比,细菌纤维具有多种优良的特性,如不含木质素和半纤维素、具有良好的吸水性、纯度高、洁净度高、良好的生物适应性和良好的机械强度,并且在自然界中可以降解而不会产生污染等特性[36-38]。同时其作为一种纤维素添加到食品中,可以充当膳食纤维的作用。在部分东南亚国家,细菌纤维素膜是一种深受大众喜爱的风味食品[39]。

在生产细菌纤维的工艺优化上,国内外已有较多研究,如谭丽丽[40]用响应面法对红茶菌发酵产细菌纤维中的温度、接种量、种龄、培养液初始值等条件进行了优化。周艳等[41]运用纯种培养红茶菌来制备细菌纤维且对碳源、茶叶种类、茶叶用量、种龄、温度和装液量六个条件进行了优化。李昊燃[42]对红茶菌中产纤维素的细菌进行了分离与鉴定,并对其纯种发酵产生细菌纤维时不同的碳源、氮源、有机酸、磷盐、温度、初始pH和初始接种量等条件进行了优化。Goh等[43]研究了蔗糖浓度和发酵时长对细菌纤维的影响,发现在90 g/L蔗糖浓度下细菌纤维的产量最高,并且随着发酵时间的延长细菌纤维的厚度和重量都有所增加。Jayabalan等[44]分析红茶菌发酵过程中细菌纤维的生化性质,发现在细菌纤维中含有粗纤维、粗蛋白和硫氨酸,且其中的成分含量随着发酵时间的延长而增多。任泽祺等[45]通过直接干燥法、冷冻干燥法和匀浆后干燥法三种方法对细菌纤维进行干燥,运用扫描电镜和红外光谱分析了不同烘干方法对细菌纤维的影响作用。程朝辉[46]尝试了通过流加的方式进行细菌纤维的发酵生产,发现每隔1 d向三角瓶中流加20 mL新鲜液体培养基,细菌纤维素的产量最高,添加葡萄糖能较大程度提高细菌纤维产量,但随着葡萄糖的添加,葡萄糖的转化率也会降低。丁勇等[47]在发酵过程中添加透明质酸后发现,发酵产生的细菌纤维复水率和热稳定性都有不同程度的提高,添加量为1 g/L时效果最佳。Stefan-Ovidiu Dima[48]对红茶菌纳米细菌纤维的提纯方法做了优化等相关研究,认为纳米细菌纤维在各个领域内具有广阔的应用前景。

2.3 红茶菌细菌纤维的应用

G S Murugesan等[49]研究了红茶菌细菌纤维中的成分,干的细菌纤维其植酸酶活性达到23 IU/mg,通过向肉鸡饲料中添加150 g/kg的细菌纤维明显提高了肉鸡的采食量、重量,并通过用细菌纤维喂食肉鸡方式进行病理学实验,结果发现对肝脏完全没有损害且死亡数为零。

红茶菌的细菌纤维对金属离子具有吸附作用,在污染防治方面具有一定的应用前景。Stefanie Hopfe等[50]利用红茶菌中微生物的降解作用将废弃荧光粉中的稀土元素释放出来,发现直接使用摇瓶培养的红茶菌或其上清液稀土浸出率最高。S. Mamisahebei等[51]发现用FeCl3对红茶菌的细菌纤维进行预处理后可以提高其生物吸附效果,他们对pH、不同离子处理等条件下细菌纤维对砷的吸附效果做了动力学研究,在pH6～8时,经FeCl3预处理后的细菌纤维对砷的吸附量为3.98×10-3mmol/g。Radojka Razmovski等[52]用动力学模型研究了红茶菌细菌纤维对Cu2+和Cr(VI)的吸附作用,发现当pH分别为2.0和4.0时吸附效果最佳。鲁敏[53]用响应面法优化了改性红茶菌细菌纤维的制备工艺条件,研究了改性细菌纤维对Cd2+、Pb2+、Cu2+和Cr(VI)的吸附作用,通过动力学模型分析改性细菌纤维吸附的机理。贾丹等[54]以细菌纤维为载体,用静态吸附法固定白腐真菌对染料污水进行处理,发现其对单一染料去除率高达98%以上,对混合染料废水色度去除率达92%。随着近年来环境问题越发得到重视,细菌纤维有望成为一种新型的治理水体污染的新材料。可以尝试对重金属污染的河流大量加入这种细菌纤维来吸附水体中的重金属,同时细菌纤维中大量的醋酸菌在水体中存活,并且持续产生细菌纤维起到持续修复的作用,这种醋酸菌应是一种高产细菌纤维且抗逆性较好的菌种。

红茶菌的细菌纤维可能成为一种新型材料。Czaja等[55]认为由醋酸杆菌产生的细菌纤维因其在化学稳定性、分子结构和机械强度上的优良特性,在未来材料的革新上拥有良好的应用前景。唐水佳[56]运用纳米细菌纤维来制作生物医用材料并进行了评价,通过在纺织基血管坯材上涂覆一层贯穿纺织基管坯材料的细菌纤维素抗凝血层,进行细菌纤维替代普通人造血管的可行性试验。蒋燕光[57]用红茶菌和木醋杆菌发酵产生纳米细菌纤维对已有管状材料进行改进,并进行了多项性能测试,同时对其作为人工血管的可行性做了分析,认为纳米细菌纤维有作为人工血管的巨大潜力。Zhu等[58]发现红茶菌细菌纤维对原代培养的神经鞘细胞具有良好的生物适应性,在小鼠体肌间隙中埋入细菌纤维后,数周后对比对照组小鼠在血细胞数量、血清生化指标和神经组织反应上没有明显的区别。

3 红茶菌的益生功效

红茶菌中的大部分益生功效都归功于其中的一个重要功能因子D-葡糖糖二酸1,4-内酯(D-Saccharic acid 1,4-lactone,DSL)。DSL存在于大部分红茶菌中,但也有少数红茶菌,由于菌种、发酵条件等原因而检测不到DSL。Bhattacharya等[59]用四氧嘧啶(alloxan,ALX)注射小鼠导致其糖尿病,同时检测到其体内caspase-3表达量明显提高,而喂食DSL的糖尿病小鼠可以抵抗糖尿病引起的各项体内血清学变化指标;DSL还可以通过降低肾脏细胞的氧化应激来达到保护肾脏的功能[60]。Rashid等[61]用喂食DSL的老鼠通过对脾脏注射ALX,研究DSL对脾脏细胞的减伤效果和作用机制,并认为DSL可作为一种改善糖尿病和调节脾脏失调的成分。

3.1 抗氧化性

Bhattacharya等[62]发现,红茶菌的抗氧化性能比普通红茶要高,同时喂食红茶菌母液的小鼠在糖尿病症状上有所缓解,推测由于其具有的抗氧化能力使得DNA的断裂和胰腺组织中caspase-3活化得以修复。Bhattacharya等[63]研究红茶菌在小鼠体内对叔丁基过氧化氢(TBHP)的消除能力,同时研究了红茶菌对其消除的分子机理。结果表明,红茶菌里的某些物质可能通过作用于线粒体和其本身的抗氧化物质调节了体内的氧化应激,同时减轻肝脏细胞的凋零。Jayabalan等[64]用红茶、绿茶、废弃茶叶来发酵红茶菌,发现随着发酵时间的延长,母液中的总酚含量、对DPPH和超氧化物的清除能力、抑制羟基自由基介导的亚油酸的能力随之提高,而羟自由基的清除能力和抗脂质过氧化的能力会减弱。推测其原因可能为一些酵母和细菌分泌的酶改变了其中一些抗氧化成分的构型。Malbaša等[65]用三种不同的菌(醋酸菌加接合属酵母、醋酸菌加酿酒酵母、传统红茶菌发酵剂)分别对绿茶和红茶进行发酵,考察对羟基和DPPH自由基的清除能力。结果发现,以传统发酵剂发酵的绿茶和醋酸菌加接合属酵母发酵的红茶和绿茶的抗氧化性能最佳,并推测可能是由于不同菌种发酵导致其中所含的VC和有机酸含量不同。王冬梅等[25]对以芦荟、玉米、红薯糖浆为底物发酵的母液进行抗氧化性研究,发现芦荟发酵的抗氧化性能最好,玉米次之;随着发酵时间的延长,羟基清除能力和抗氧化值(AOV)也随之增强,在4～6 d达到最大值,这和Jayabalan[61]和俸毅等[66]的研究结果一致;同时随着发酵时间进一步的延长,抗氧化活性物质含量不再增加反而缓慢下降,且母液的抗氧化活性变化曲线与菌体生长曲线相一致。朱晓庆[67]在研究红茶和绿茶发酵液抗氧化性时发现,发酵前6 d两种发酵液总酚含量、还原力、对羟自由基和超氧阴离子的清除能力都在上升,且具有显著的正相关性;随着发酵时间的进一步延长,总酚含量、还原力、对羟自由基和超氧阴离子的清除能力均无明显变化,在总酚含量、还原力和DPPH的清除能力上,绿茶发酵要优于红茶发酵,而红茶发酵在羟自由基和超氧阴离子清除能力上要明显优于绿茶发酵。丁艳如等[68]对红茶菌发酵过程中的各项指标,包括抗氧化能力(DPPH、羟自由基和超氧负离子清除率)进行检测,认为还原力大小与抗氧化活性密切相关,且酚类可能是红茶菌中抗氧化的关键物质。

Murugesan等[69]用红茶、酶处理茶和红茶菌对比研究三者对大白鼠肝脏损伤(损伤由四氯化碳引起)的治愈能力,发现三者都具有一定的损伤修复功能,但红茶菌的修复能力最佳,推测原因可能是在红茶菌发酵过程中产生的抗氧化物质导致的。Jayabalan等[70]以红茶作为对比,研究红茶菌对肝脏损伤(由黄曲霉毒素B1引起)的预防和抵抗作用,发现红茶菌在预防和抵抗肝脏损伤的效果上明显优于红茶,其可能的机理是红茶菌中的功能物质对肝脏有抗氧化和解毒的作用。Ibrahim[71]研究了红茶菌对大白鼠肝肾病变(由CdCl2或γ射线引起)恢复能力的影响,结果表明红茶菌可能通过抵抗由铅或γ射线造成的氧化损伤来保护肝肾。Bhattacharya等[72]对离体鼠肝细胞用TBHP进行处理后,研究肝细胞凋零的数量、线粒体膜电位的变化、细胞色素C的释放、caspases3、caspases9和凋亡酶激活因子(apoptotic protease activating factor-1,APAF-1)的激活等,发现红茶菌可以有效地保护肝细胞免受氧化损伤,并维持其正常的生理;结果表明,红茶菌是通过抗氧化活性物质的作用和抗氧化物质直接作用于线粒体,从而调节氧化应激来减少肝细胞的凋零。Abshenas等[73]研究红茶菌对小鼠肝脏的保护作用,通过对各项组织病理学的指标评价,发现红茶菌能有效保护肝脏免受对乙酰氨基酚的损害。虽然大部分的研究在实验材料、试剂、方法等都各不相同,但几乎所有的文章都得出同一个结论,即:红茶菌的护肝作用都是由于其中的抗氧化成分对肝脏起了抗氧化或调节氧化应激等实现的,但也有认为DSL是护肝作用的关键成分[74]。针对红茶菌生理作用的研究,在国外已经涌现出大量相关的论文,而国内在这方面的研究还比较欠缺,且目前尚未有文章对其具体的作用机理进行详细报道,这方面可以作为红茶菌研究的一个大方向。

3.2 抑菌活性

目前,大多数研究认为:红茶菌中具有抑菌活性的主要成分为母液中的有机酸、多酚类物质抑菌蛋白。Talawat等[75]用多种茶(桑叶茶、日本煎茶、茉莉花茶、乌龙茶和红茶)进行发酵,研究各个发酵液对病原菌(霍乱弧菌、伤寒沙门氏杆菌、绿浓杆菌、哈氏弧菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌和创伤弧菌)生长的抑制作用,发现红茶发酵液的抑菌效果最好,并通过高效液相色谱分析发酵液成分,认为发酵液中的有机酸如琥珀酸和葡萄糖酸是抑菌的主要成分。Battikh等[76]用红茶和绿茶进行发酵,研究发酵液对人体病原菌(表皮葡萄球菌、金黄色酿脓葡萄球菌、藤黄微球菌、大肠埃希氏菌、绿浓杆菌、金鼠伤寒沙门氏菌和单增李斯特菌)和真菌(念珠菌属)的抑菌效果,发现绿茶发酵液的抑菌效果最好,特别在表皮葡萄球菌、藤黄微球菌和单增李斯特菌的抑菌效果上的表现较为突出;同时,从对念珠菌属的抑制效果来看,其有潜力作为念珠菌属的抑制物。李璐路[15]用红茶、绿茶和普洱茶作为底物,用传统红茶菌菌膜进行发酵,研究三者发酵液的抑菌活性(指示菌为大肠杆菌和枯草芽孢杆菌),发现三种底物的抑菌效果相差不大,且随着发酵的进行,发酵液的pH、细菌数量和总蛋白浓度提高,同时抑菌效果也有所增强;将红茶菌中分离的菌种纯培养后进行混合发酵,发现相比传统发酵,对指示菌的抑菌效果更强,且调节pH至4.0(为排除pH对抑菌作用的影响)时抑菌效果明显变弱但未完全丧失,推断红茶菌中的抑菌作用为抑菌蛋白和酸性物质共同作用的结果。Ali等[77]用一种印度家庭自酿的红茶菌进行抑菌活性的研究,发现只有在25 ℃和pH4.5时才能对大肠埃希氏菌和沙门氏菌产生抑制,而对金黄色酿脓葡萄球菌毫无抑制作用,这与Battikh等[78]的结果并不相符,有可能是由于民间自酿的红茶菌非纯种发酵制成,以及发酵过程中的杂菌污染或菌种构成和发酵用料等差异导致的。Battikh等[79]用多种植物(百里香、柠檬过江藤、迷迭香、茴香和洋薄荷)提取液进行发酵,研究了各发酵液的抑菌活性,发现柠檬过江藤和茴香的发酵液对病原菌和念珠菌属有明显的抑菌作用,可以作为一种健康的发酵底物。谢俊杰等[76]研究了红茶菌发酵过程中抗菌率(金黄色微球菌为指示菌)变化过程,结果显示在发酵初期,随着发酵的进行抗菌率逐渐提升,在达到最大值后开始缓慢下降。蒋立文[80]用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌,分别对茶水浓度、发酵液pH和分别经胰蛋白酶、过氧化氢酶、蛋白酶K处理的发酵透析液进行了抑菌效果的研究,发现茶叶浓度为1.0%(W/V)、红茶菌发酵液及发酵液的透析液对指示菌生长均有抑制效果,经胰蛋白酶、蛋白酶处理的样品液对指示菌抑制效果明显降低,并认为红茶菌发酵液中存在抑菌蛋白,且红茶发酵液的抗菌作用是由酸性物质、抗菌蛋白、茶多酚协同作用的结果。

4 结论与展望

红茶菌作为一种在世界上广为流传的健康饮料,其各种益生功效在近年已被广泛提及,并有很多之前我们并没有认识到的功效在不断被发现。但由于红茶菌发酵所用的菌种、底物和发酵条件等的不同,其母液中含有的成分也各不相同,导致每种红茶菌的益生也不尽相同。同时通过红茶菌发酵得到的细菌纤维,在未来新材料的应用上具有广阔的前景。随着纳米技术的进步,纳米细菌纤维由于其优异的特性可作为以后研究的方向。红茶菌不仅仅是一种单纯的饮料,其中的各种抗氧化物质和抑菌物质及各种功能因子都值得我们去关注。在以后的研究中可以尝试分析和分离其中的功能性成分。该类物质不仅能起到抗氧化和抑菌的作用,对人体无毒无害,因而是一种有潜力的食品或食品添加剂。

国内现在对红茶菌的研究仍然以食品方向为主,主要针对发酵条件等进行优化,对于红茶菌在非食品领域方面如重金属吸附等环境保护方面的研究仍相对不足,同时由于菌种的不固定,各种优化在不同菌种构成的红茶菌中未必具有适用性,而且这些条件的优化都仅局限于摇瓶实验,而在发酵罐发酵方面的优化少有提及。而国外针对红茶菌的研究已经转向红茶菌的应用方面,如运用红茶菌回收荧光废料中的稀土元素和重金属的吸附等环境保护方面。国内外对于红茶菌中的细菌纤维的研究则基本集中于其纤维纳米化和纳米化细菌纤维在医疗方面的运用。

目前国内外尚未有人通过将大量的菌种进行混合搭配发酵确定最优菌种组成,在关于推荐发酵菌种方面也没有任何报道。红茶菌由于发酵时间较长,导致大批量的菌种搭配发酵实验工作量巨大,可以尝试通过微容器进行混合菌种的发酵,并以DSL或其他重要功能因子为指标,通过高通量筛选的方法,选择出以该功能因子为主产物的最佳发酵菌种配比,为后续工业发酵的菌种选用提供推荐菌种;同时,还可以研究该菌种搭配下各菌种间相互作用对该种功能因子的影响和分子作用机理,为后续更好的指导发酵生产打下基础。