脑脊液与外周血T—SPOT.TB对结核性脑膜炎诊断价值的比较

宋韬 付洪义 李莉娟

[摘要] 目的 評价脑脊液T-SPOT.TB对结核性脑膜炎的诊断价值。 方法 选取2012年1月～2016年6月河北省胸科医院结核内科收治的疑诊为结核性脑膜炎的147例患者，同时进行脑脊液及外周血的T-SPOT.TB，依据患者的最终诊断，将遴选的133例分为结核性脑膜炎组和非结核性脑膜炎组，比较脑脊液及外周血的T-SPOT.TB的阳性率与阴性率。 结果 所选患者中，结核性脑膜炎76例，非结核性脑膜炎57例。外周血T-SPOT.TB的敏感性为77.63%，与脑脊液的63.16%比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；脑脊液T-SPOT.TB的特异性为98.25%，高于外周血的84.21%，差异有统计学意义（P < 0.05）；脑脊液的T-SPOT.TB的阳性预测值为97.96%，高于外周血的86.76%，差异有统计学意义（P < 0.05）；外周血的T-SPOT.TB的阴性预测值为73.85%，与脑脊液的66.67%比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。当脑脊液的T-SPOT.TB的cut-off值在96 SFCs/106PEMC时，诊断结核性脑膜炎的敏感性为90.79%，特异性为98.25%，阳性预测值为98.57%，阴性预测值为88.89%，ROC曲线下面积为0.993（95%CI：0.982～1.000）。 结论 与外周血的T-SPOT.TB比较，脑脊液的T-SPOT.TB可大幅提高对结核性脑膜炎的特异性和阳性预测值，可显著提高结核性脑膜炎的诊断水平。

[关键词] T-SPOT.TB；结核性脑膜炎；脑脊液；外周血；敏感性；特异性

[中图分类号] R529.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）06（a）-0050-05

[Abstract] Objective To evaluate the diagnostic value of T-SPOT.TB in cerebrospinal fluid for tuberculous meningitis. Methods A total of 147 inpatients of suspected tuberculous meningitis in the Department of TB Medicine of Hebei Chest Hospital from January 2012 to June 2016 were selected. Based on final diagnosis， 133 patients were divided into two groups： tuberculous meningitis group and non tuberculous meningitis group. The positive and the negative rates of T-SPOT.TB in cerebrospinal fluid and peripheral blood were compared. Results Among the patients， there were 76 cases of diagnosed tuberculous meningitis， and 57 cases of non tuberculous meningitis. The sensitivity of T-SPOT.TB in peripheral blood was 77.63%， compared with 63.16% of T-SPOT.TB in cerebrospinal fluid， there was no statistically significant difference （P > 0.05）. The specificity of T-SPOT.TB in cerebrospinal fluid was 98.25%， significantly higher than 84.21% of T-SPOT.TB in peripheral blood， the difference was statistically significant （P < 0.05）. The positive predictive value of T-SPOT.TB in cerebrospinal fluid was 97.96%， higher than 86.76% of T-SPOT.TB in peripheral blood， the difference was statistically significant （P < 0.05）. The negative predictive value of T-SPOT.TB in peripheral blood was 73.85%， compared with 66.67% of T-SPOT.TB in cerebrospinal fluid， there was no statistically significant difference between the results （P > 0.05）. Taking 96 SFCs/106PEMC as the cut-off value， the sensitivity， specificity， PPV， NPV and AUROC of T-SPOT.TB in cerebrospinal fluid in diagnosis of tuberculous meningitis were 90.79%， 98.25%， 98.57%， 88.89% and 0.993 （95%CI： 0.982-1.000）， respectively. Conclusion Compared with T-SPOT.TB in peripheral blood， the T-SPOT.TB in cerebrospinal fluid can significantly improve the specificity and PPV， and accurate diagnosis level of tuberculous meningitis.

[Key words] T-SPOT.TB； Tuberculous meningitis； Cerebrospinal fluid； Peripheral blood； Sensitivity； Specificity

结核性脑膜炎是一种严重的继发性结核病，是结核分枝杆菌引起的颅内非化脓性炎症性疾病[1]，由于疾病所累及解剖部位的重要性和病理变化的复杂多样性，决定了结核性脑膜炎是最严重的结核病，一旦误诊或漏诊，往往会出现严重后果，造成较高的死亡率和致残率[2]。这就需要一种微创甚至是无创、快速而又准确的诊断结核性脑膜炎的方法。T-SPOT.TB以其对结核分枝杆菌独有的敏感性和特异性被广泛应用于临床[3]，目前主要用于外周血的检测，由于结核分枝杆菌所引起的保护性免疫反应是大量的释放γ-干扰素的淋巴细胞趋化、聚集至感染部位，因此脑脊液的T-SPOT.TB的结果可能比外周血更准确[4]。本研究在河北省胸科医院（以下简称“我院”）结核内科开展，对疑诊为结核性脑膜炎的住院患者，同时进行脑脊液及外周血的T-SPOT.TB，比较脑脊液及外周血的T-SPOT.TB对结核性脑膜炎的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年1月～2016年6月我院结核内科疑诊为结核性脑膜炎的住院患者147例，同时进行脑脊液及外周血的T-SPOT.TB，根据患者的结核菌培养、抗酸染色以及临床表现、影像学检查、脑脊液检查、临床治疗效果，剔除14例不能确诊的病例后，将明确诊断的133例患者作为研究对象，分为结核性脑膜炎组和非结核性脑膜炎组。研究对象纳入标准：①年龄18～65岁；②有脑膜刺激征或脑神经、脊髓损害表现或颅内压增高的表现；③抗结核治疗4周之内；④签署知情同意书并经医院医学伦理委员会批准。排除标准：①既往有结核病病史、糖尿病、风湿免疫病史及其他肺部疾病史；②合并艾滋病病毒感染；③妊娠；④既往有严重肝肾功能衰竭病史，近期（3个月）应用免疫抑制剂及增强剂。分组标准：①结核性脑膜炎组：脑脊液结核分枝杆菌培养阳性或抗酸染色阳性；有发热、乏力、纳差、盗汗、消瘦等典型的结核中毒症状，结核菌素皮肤试验强阳性和/或结核抗体阳性，实验室检查（常规、生化）符合结核性脑脊液特点，抗结核治疗有效；②非结核性脑膜炎组：实验室检查及临床转归均不支持结核性脑膜炎的诊断，可明确诊断为其他疾病，且治疗原发病有效。133例研究对象知情同意进行检测，根据分组标准，结核性脑膜炎组76例，其中男63例（82.89%），女13例（17.11%）；年龄18～64岁，平均（37.6±3.2）岁。非结核性脑膜炎组57例，其中男46例（80.70%），女11例（19.30%）；年龄18～61岁，平均（39.4±4.2）岁。两组患者性别、年龄比较差异均无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂和仪器

1.2.1.1 主要试剂 （1）无血清培养基：RPMI 1640，PPA laboratory Gmbh。AIM-VTM，Invitrogen公司。（2）PBMCs分离液：LymphoprepTM，Ads-Shield PocAS.Oslo.Norway。（3）无水乙醇（分析纯），上海彤晟化工科技有限公司。（4）PBS缓冲液：1×D-PBS（catalogue number 14040-091），美国GIBCOTM公司。（5）T-SPOT.TB试剂盒，Oxford Immunotec，Abingdon，UK，包括：①微孔培养板：96（12×8）孔，由板条组成，外层披覆有无毒的小鼠抗人的γ干扰素单抗（INF-γ）；②抗原A（0.8 mL/瓶）：其内含有ESAT-6抗原以及牛血清白蛋白和抑菌剂；③抗原B（0.8 mL/瓶）：其内含有CFP-10抗原以及牛血清白蛋白和抑菌剂；④PHA对照（0.8 mL/瓶）：其内含有用于监控细胞活性的植物血凝素PHA以及牛血清白蛋白和抑菌剂；⑤200倍浓缩的标记抗体（50 μL）：其内含有碱性磷酸酶标记的小鼠的抗人γ-干扰素单抗；⑥显色底物溶液（25 mL）：其内含有BCIP/NBTplus。

1.2.1.2 主要仪器 二级生物安全柜，美國Thermo Scientific公司。流式细胞仪，美国BD公司，进行PBMCs记数。ELISPOT分析仪，德国ADI公司，进行斑点记数。37℃，90%湿度，5%CO2培养箱，美国Thermo Scientific公司。4℃冰箱BCD-257SL，青岛海尔股份有限公司。超大容量低温离心机，美国Thermo Scientific公司。台式振荡器Vortex-Geniez，上海易扩仪器有限公司。电热恒温水槽，上海精宏实验设备有限公司。新型全自动恒温鼓风干燥箱，上海智城分析仪器制造有限公司。移液器，美国Thermo Scientific公司。肝素锂真空采血管（CPT，4 mL），美国BD公司。流式标本检测管，美国BD公司。细胞计数板，美国HYCOR生物医学公司。

1.2.2 T-SPOT.TB（ELISPOT法）

采集受试者肝素抗凝脑脊液4 mL和肝素抗凝外周血4 mL，并由研究人员在6 h内完成外周血及脑脊液T-SPOT.TB检测。T-SPOT.TB检测以AIM-VTM作为空白对照，植物血凝素（PHA）作为阳性对照，分别以结核分枝杆菌特异性ESAT-6和CFP-10肽段库作为刺激原。密度梯度离心分离脑脊液和外周血中单个核细胞。在预先包被抗γ干扰素（IFN-γ）单抗的微孔板上，分别加入抗原和脑脊液单个核细胞或外周血中单个核细胞（2.5×109/L），将微孔板置于37℃、90%湿度、5%CO2培养箱中孵育18～20 h，加入二抗及显色底物，显色6～8 min。将微孔板置于通风、避光、干燥处过夜，应用酶联免疫斑点测定法（ELISPOT）分析仪计数斑点，每一个斑点代表一个分泌IFN-γ特异性T细胞。目视法判定标准：阳性对照孔内斑点数≥20个视为实验有效；阴性对照孔内斑点数为≤5个，任一实验孔内斑点数-阴性孔斑点数≥6个，认定结果为阳性；若阴性对照孔内斑点数≥6个，任一实验孔内斑点数≥阴性孔斑内点数×2，认定结果为阳性；若任一实验孔内斑点数<20个，且阳性对照孔内斑点数≥20个，认定结果为阴性。

1.3 观察指标

比较脑脊液及外周血的T-SPOT.TB的阳性率与阴性率。计算灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值。敏感度=真阳性/（真阳性+假阴性）×100%；特异度=真阴性/（假阳性+真阴性）×100%；阳性预测值=真阳性/（真阳性+假阳性）×100%；阴性预测值=真阴性/（真阴性+假阴性）×100%。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑脊液及外周血的T-SPOT.TB对结核性脑膜炎的诊断效能

76例诊断为结核性脑膜炎的患者中，59例外周血T-SPOT.TB检测阳性，外周血T-SPOT.TB检测的敏感性为77.63%；48例脑脊液T-SPOT.TB检测阳性，脑脊液T-SPOT.TB检测的敏感性为63.16%，二者差异无统计学意义（χ2=3.82，P > 0.05）。见表1。

57例为非结核性脑膜炎的患者中，9例外周血T-SPOT.TB检测阳性，外周血T-SPOT.TB检测的特异性为84.21%；1例脑脊液T-SPOT.TB检测阳性，脑脊液T-SPOT.TB检测的特异性为98.25%，二者差异有统计学意义（χ2=7.015，P < 0.05）。见表1。

外周血T-SPOT.TB检测阳性的患者中59例诊断为结核性脑膜炎，9例诊断为非结核性脑膜炎，外周血T-SPOT.TB检测的阳性预测值为86.76%；脑脊液T-SPOT.TB检测阳性的患者中，48例诊断为结核性脑膜炎，1例诊断为非结核性脑膜炎，脑脊液T-SPOT.TB检测的阳性预测值为97.96%，二者差异有统计学意义（χ2=4.566，P < 0.05）。见表2。

外周血T-SPOT.TB检测阴性的患者中17例诊断为结核性脑膜炎，48例诊断为非结核性脑膜炎，外周血T-SPOT.TB检测的阴性预测值为73.85%；脑脊液T-SPOT.TB检测阴性的患者中，28例诊断为结核性脑膜炎，56例诊断为非结核性脑膜炎，脑脊液T-SPOT.TB检测的阴性预测值为66.67%，二者差异无统计学意义（χ2=0.896，P > 0.05）。见表2。

2.2 脑脊液及外周血的T-SPOT.TB诊断结核性脑膜炎的ROC曲线

在诊断明确的76例结核性脑膜炎患者中，以病原学或临床诊断标准作为诊断结核性脑膜炎的标准，以释放INF-γ的T细胞频数为评价指标绘制ROC曲线，分析诊断结核性脑膜炎的cut-off值。当脑脊液的T-SPOT.TB的cut-off值在96 SFCs/106PEMC，诊断结核性脑膜炎的敏感性为90.79%，特异性为98.25%，阳性预测值为98.57%，阴性预测值为88.89%，ROC曲线下面积为0.993（95%CI：0.982～1.000）。见图1。

3 讨论

伴随我国肺结核发病人数逐年增加，结核性脑膜炎人数也不断增多，结核性脑膜炎早期临床表现特异性差[5-6]，常被误诊为隐球菌脑膜炎、化脓性脑膜炎或病毒性脑膜炎而延误治疗，即使在抗结核药物广泛应用的现代，其病死率及致残率仍极高，文献报道为20%～69%[7-9]。目前临床上常见的检测方式有结核菌素实验（PPD实验）、脑脊液涂片、染色、镜检以及外周血血象和影像学检测等[10-13]。但确诊结核性脑膜炎需要脑脊液中结核分枝杆菌培养阳性或者涂片发现抗酸杆菌，但脑脊液中结核菌量极少，阳性检出率极低，故医疗工作者迫切需要寻找一种新的、微创甚至是无创、快速而又准确的检测技术，提高结核性脑膜炎的诊断准确性，改善患者预后。

T-SPOT.TB是近年来结核病诊断技术的重大突破。大量实验数据表明，外周血T-SPOT.TB对结核感染的诊断有较高的敏感性和特异性，但其在不同部位的结核病中敏感性不一，在结核高流行地区特异性不佳，不能区分活动性结核和潜伏结核感染，使其临床应用受限[14]。由于结核性脑膜炎的发生是结核分枝杆菌及其特异性抗原与致敏的CD4+T细胞为主的相互作用的过程，脑脊液中的各种细胞因子，例如IFN-γ、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-6（IL-6）等水平均显著高于外周血，局部病变呈现隔室化反应[15]，这种反应使得抗原特异性T细胞向病变部位聚集，外周血抗原特异性T细胞数量减少，从而使结核性脑膜炎患者脑脊液中效应T细胞数量与外周血相比可能增高。

目前国内外对脑脊液T-SPOT.TB诊断结核性脑膜炎的研究逐渐增多，韩国的Kim等[16]首先对脑脊液与外周血T-SPOT.TB诊断结核性脑膜炎的价值进行评估，结果显示脑脊液与外周血T-SPOT.TB对诊断结核性脑膜炎的敏感性为75%和91%。本研究也显示外周血T-SPOT.TB对诊断结核性脑膜炎的敏感性高于脑脊液，但二者比较无统计学差异。此后Thomas等[17]的研究也表明腦脊液T-SPOT.TB能早期诊断结核性脑膜炎。近期国内李雪莲等[18]的研究也表明脑脊液T-SPOT.TB诊断结核性脑膜炎的特异性较高，而外周血T-SPOT.TB检测的敏感性较高，与其他国内既往研究结果[19]一致。本研究也显示在结核性脑膜炎患者中，脑脊液T-SPOT.TB的特异性和阳性预测值均高于外周血，比较有统计学差异，可见脑脊液T-SPOT.TB能够更加准确地诊断结核性脑膜炎。这弥补了外周血T-SPOT.TB检测的不足[20]。目前外周血T-SPOT.TB无法确定一个理想的cut-off值来鉴别活动性结核病和潜伏结核感染，但当脑脊液的T-SPOT.TB的cut-off值在96 SFCs/106PEMC，诊断结核性脑膜炎的敏感性和特异性均在90%以上。脑脊液的T-SPOT.TB检测有望弥补外周血T-SPOT.TB特异性偏低的缺点，使其用于结核病高负担国家对结核性脑膜炎的早期诊断变得可能，但这仍需大样本量的研究来验证。

综上所述，与外周血的T-SPOT.TB相比，脑脊液的T-SPOT.TB可大幅提高对结核性脑膜炎的特异性和阳性预测值，可显著提高结核性脑膜炎的诊断水平。

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