流式荧光法检测胃蛋白酶原Ⅰ与Ⅱ的评价及应用分析*

何忠发,骆安德,卢彦蕙,陈耀良,蒙顺武,罗雪林,覃 聪

(1.广西壮族自治区来宾市人民医院检验科 546100;2.广西壮族自治区来宾市中医医院检验科 546100)

胃癌组织分泌物中含有胃蛋白酶原Ⅰ、Ⅱ(PGⅠ、Ⅱ)，测定PG有助于分析胃的分泌能力。血清PGⅠ、PGⅡ水平的变化可以反映胃黏膜的功能，因此对其准确的测定在胃癌早期的筛查与疗效监测上具有重要意义。流式荧光法是基于荧光编码微球和流式技术的一种临床应用型高通量发光检测技术，具有通量高、配套试剂多、应用领域广、重复性好，既能检测蛋白质又能检测核酸等优点[1]。因此，流式荧光法被广泛应用于胃部疾病的检查。化学发光法也是临床常用检测方法之一。有研究显示，流式荧光法与化学发光法检测PGⅠ、PGⅡ的结果在中等浓度方面基本一致[2-3]。但是对低浓度检测的研究也是分析该方法的重要方面，本研究对流式荧光法检测PGⅠ、PGⅡ的方法学进行评估，并与化学发光法检测的结果进行对比分析，探讨两种检测方法检测PGⅠ、PGⅡ上的差异。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2013年12月至2015年9月来宾市人民医院收治的胃疾病患者155例(患者纳入例数参考文献[4])，其中浅表性胃炎44例，萎缩性胃炎42例(幽门螺杆菌感染29例，无幽门螺杆菌感染13例)，胃癌69例(早期39例，晚期30例)；年龄22～79岁，平均(39.9±22.9)岁。选取同期在来宾市人民医院体检健康者145例，年龄23～80岁，平均(40.3±12.6)岁，无胃部疾病。两组研究对象一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2仪器与试剂 PGⅠ、PG Ⅱ流式荧光定量测定试剂盒(上海透景生命科技有限公司)，Luminex 200多功能流式点阵仪(上海透景生命科技有限公司)；PGⅠ、PGⅡ化学发光微粒子免疫测定试剂盒(美国Abbott公司)，i-2000全自动化学发光免疫分析仪(美国Abbott公司)。

1.3方法

1.3.1PGⅠ、PGⅡ检测 流式荧光法严格按照流式荧光定量测定试剂盒的说明书进行操作，采用Luminex 200多功能流式点阵仪进行PGⅠ、PGⅡ定量测定；化学发光微粒子免疫检测法按Abbott公司试剂盒说明书操作。

1.3.2标准曲线的制作 测定0.4、1.0、5.0、10.0、50.0、200.0 ng/mL PGⅠ、PGⅡ混标液中PGⅠ、PGⅡ水平，建立回归方程，计算回归方程及相关系数(r)。

1.3.3流式荧光法检测PGⅠ、PGⅡ的评价试验 取10 ng/mL PGⅠ、PGⅡ混标溶液进行重复性试验，根据峰面积计算PGⅠ、PGⅡ检测结果的相对标准偏差(RSD)[5]；取9份浅表性胃炎患者血清样本进行回收试验，参考王绍亮等[6]的回收试验方法，计算9个样本PGⅠ、PGⅡ的水平，以平均值表示样品中PGⅠ、PGⅡ的初始水平；取同一胃炎患者血清样本4份分别加入0.4、10.0、200.0 ng/mL的PGⅠ、PGⅡ混标液，然后测定PGⅠ、PGⅡ的水平，计算回收率=[(测定待测回收样本浓度均值-测定基础样本浓度均值)/加入浓度]×100 %；在不同水平的PGⅠ、PGⅡ中加入干扰剂三酰甘油200 mg/mL、胆红素20 mg/mL、血红蛋白 20 mg/mL，计算回收率以分析抗干扰能力。

1.3.4灵敏度和特异度实验 以胃镜和病理诊断作为金标准，对两种方法的灵敏度、特异性进行比较，灵敏度=真阳性人数/(真阳性人数+假阴性人数)×100%，特异度=真阴性人数/(真阴性人数+假阳性人数)×100%。

2 结 果

2.1流式荧光法检测PGⅠ、PGⅡ基本参数分析 流式荧光法检测PGⅠ、PGⅡ线性回归方程为Y=62.49X+1.61和Y=41.18X+2.85，r=0.998 5、0.998 8，线性范围为0.35～190.00 ng/mL和0.32～200.00 ng/mL检出限为0.02 ng/mL和0.04 ng/mL。

2.2流式荧光法检测PGⅠ、PGⅡ评价试验 流式荧光法检测10 ng/mL的PGⅠ、PGⅡ结果分别为9.3、9.1、9.5、9.8、9.2 ng/mL和9.5、9.0、9.2、9.9、9.3 ng/mL，相对标准偏差为2.96%和3.65%；流式荧光法检测PGⅠ、PGⅡ在基础浓度4.51 ng/mL和2.74 ng/mL，加入浓度为0.4、10.0和200.0 ng/mL的平均回收率为98.3%～100.1%和95.8%～100.0%；流失荧光法在PGⅠ和PGⅡ基本浓度为15.66、22.65、23.69 ng/mL和5.69、5.50、5.68 ng/mL，三酰甘油、胆红素和血红蛋白水平为200、20、20 mg/mL情况下，回收率分别为99.1%、98.7%、97.0%和91.2%、96.5%、103.5%。

2.3流式荧光法检测PGⅠ、PGⅡ灵敏度和特异度分析 流式荧光法检测PGⅠ、PGⅡ灵敏度和特异度分别为74.85%，79.02%，而化学发光法检测PGⅠ、PGⅡ灵敏度和特异度分别为63.81%，63.75%，差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 两种方法检测PGⅠ、PGⅡ灵敏度和特异度比较

2.4不同胃部疾病PGⅠ、PGⅡ结果分析 不同胃部疾病患者PGⅠ、PGⅡ结果见下表2和图1，胃癌患者PGⅠ、PGⅡ水平与其他胃部疾病患者比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5流式荧光技术与化学发光法检测结果比较 两种方法线性回归方程PGⅠ为Y=0.548 5X+2.241，r=0.988 2；PGⅡ为Y=0.558 7X+1.005，r=0.987 6。PGⅠ/PGⅡ为Y=0.624 1X+0.325 0，r=0.984 6，见表3。

表2 不同胃部疾病患者PGⅠ、PGⅡ检测结果

注：*P<0.05，与其他类型比较，HP为幽门螺杆菌

图1 不同胃部疾病PGⅠ、PGⅡ检测结果表3 流式荧光法与化学发光法检测PGⅠ、PGⅡ结果比较

疾病类型n流式荧光法PGⅠPGⅡ化学发光法PGⅠPGⅡtPPGⅠtPPGⅡ浅表性胃炎444.51±0.322.74±0.214.51±0.322.74±0.21122 20.652122 20.652HP感染萎缩性胃炎296.11±0.454.02±0.264.51±0.322.74±0.21无HP感染萎缩性胃炎134.56±0.782.99±0.086.11±0.454.02±0.26早期胃癌398.39±0.696.21±1.024.56±0.782.99±0.08晚期胃癌305.89±1.06*4.89±1.04*3.39±0.691.21±1.02

注：HP为幽门螺杆菌

3 讨 论

胃癌是比较常见的恶性肿瘤。目前对胃癌的诊断依然采用胃镜活检组织病理学进行检查，也是确诊胃癌的金标准，但是该方法在使用过程需要花费的人力及经济成本比较高，而且对患者也会造成比较大的痛苦，不少人便放弃了对胃部疾病的检查[6]。PG流式荧光技术因其具有高通量、检测效率高的特点，在临床上常用于胃癌的筛查。此方法对患者造成的痛苦比较小，而且准确性比较高，受到了广大患者及学者的关注。PG是胃液中胃蛋白酶的非活性前体，在免疫原性上分为PGⅠ、PGⅡ 2 种，PGⅠ由胃底腺分泌，PGⅡ由胃底腺、贲门腺、幽门腺和十二指肠的Brunner，S腺分泌，胃底腺黏膜萎缩过程中，分泌PGⅠ的主细胞减少，分泌PGⅡ的幽门腺细胞增多，PGⅠ/ PGⅡ比值降低[7-8]。

检测PG的方法目前报导的有酶联免疫吸附试验 (ELISA)、放射免疫分析法(RIA)、乳胶增强免疫比浊法(PETIA)、时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)[9-10]、光激化学发光免疫分析法(LICA)及化学发光法(CLIA)，检测PG的参考方法是化学发光免疫分析法[10]。本研究的PG流式荧光发光免疫测定方法，其分析血清中PG的精密度、准确度、检出限、线性，和参考方法Abbott公司化学发光法相关性良好，两法测定的结果具有一致性[10]。本研究通过流式荧光法检测PGⅠ、PGⅡ灵敏度和特异度为74.85%、79.02%，而化学发光法检测PGⅠ、PGⅡ灵敏度和特异度为63.81%、63.75%，流式荧光法检测灵敏度和特异度高。本研究通过试验，结果发现采用流式荧光技术检测PGⅠ、PGⅡ的线性范围分别为0.65～190.00 ng/mL和0.22～110.00 ng/mL，和其他研究的结果基本一致[11]。可能由于两种检测方法的原理不同，灵敏度和特异度的差距等，导致两种检测方法的线性范围差别较大。而且流式荧光法精密度和回收率均比较好，可以准确测定标本中的PGⅠ、PGⅡ。与化学发光法进行对比分析，两种方法检测PGⅠ、PGⅡ、PGⅠ/PGⅡ相关性良好，存在较好的可比性。

综上所述，流式荧光技术检测PGⅠ、PGⅡ的方法学性能比较好，与化学发光法具有良好的相关性，可在临床上推广应用。