温敏水凝胶/磷酸三钙生物复合材料的制备及其在小鼠体内的成骨研究

程丽佳， 陈 涛， 陈祖盛， 吴海慧， 牛 蓓

(成都大学 医学院， 四川 成都 610106)

0 引 言

据报道，目前在全球范围内每年都有近1 500万骨折病例的发生，导致骨移植的市场需求量不断增加[1-2].而由创伤、骨质疏松等原因造成的骨折和骨缺损具有一定的再生和自我修复能力，但人体骨的自我修复周期较长，且缺损超过一定大小，便不能自我修复愈合[3].严重的骨缺损需要通过骨移植来进行治疗，而自体骨和异体骨取材十分有限，也存在着免疫排斥反应等限制了其应用[4].研究发现，含羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)和磷酸三钙(Tricalcium Phosphate,TCP)的生物陶瓷因和骨组织具有相似的理化性质，以及良好的生物相容性、生物降解性、骨传导性和骨诱导性而常被用作骨替代物[5-8].但钙磷生物材料其粉体为无定形粉末，直接应用无法塑形，同时存在强度低、固化慢等缺点，影响了其临床应用.温敏水凝胶(Thermo-sensitive Hydrogel,TSH)聚合物是由一定比例的DL-丙交酯、乙交酯和聚乙二醇合成，其特点是在温度低于相转变温度(25±2)℃时，聚合物可溶于水形成自由流动液体，而当温度升高至相转变温度以上时，聚合物的水溶液形成凝胶形状，且凝胶形成的过程是可逆的[9].同时，TSH又是一种高分子材料，可作为固化液，在体内可起到缓释TCP的作用，其能将Ca、P离子缓慢释放并诱导形成新生骨组织，可解决TCP粉体需要烧结成型的缺点.基于此，本研究拟利用TSH在低温下溶解、高温下固化的特点及TCP的骨诱导性，在二者协同作用下制备出一种生物力学特性与天然骨相似的新型骨修复/再生材料，拟为骨替代物材料的开发提供新的路径.

1 材料和方法

1.1 材 料

实验所用的材料包括：TSH，购自济南岱罡生物工程有限公司；HA、TCP，由四川大学生物材料中心赠送；BALB/c小鼠，购自成都达硕实验动物有限公司.

1.2 TSH/TCP材料制备

称取5 g TSH与20 mL蒸馏水混合，放置于4 ℃冰箱中，每24 h搅拌30 min进行混合，3 d后得到TSH混合悬浮液.然后，按24∶76的比例加入TCP粉体，将TCP粉体与TSH悬浮液进行混合,得到TSH/TCP混合材料.最后，将TSH/TCP混合材料置于27 ℃以上，加工制得TSH/TCP复合材料.根据其可任意塑形的特性，可按需放置在模具中制成所需的形状.

1.3 材料结构

实验采用邵氏硬度检测材料硬度，利用扫描电子显微镜分析HA、β-TCP和TSH/TCP 3种生物材料的微观结构.

1.4 动物实验

30只7周周龄的BALB/c小鼠随机分为3组(n=10)，即∶TSH/TCP组(实验组)、HA组(对照组1)及β-TCP组(对照组2).实验中，采用1%戊巴比妥钠腹腔内麻醉(0.1 mg/g体重)所有小鼠，然后，对小鼠两侧大腿进行常规消毒、剃毛、备皮，切开皮肤和肌肉，制备肌袋，将3种生物材料分别植入肌袋，最后逐层缝合肌肉和皮肤.术后观察小鼠正常活动，并注射青霉素1.2万单位/g，5 d，预防感染.

1.5 组织学染色

术后12周，处死小鼠，解剖后观察小鼠体内有无异物或肿瘤组织形成，同时收获材料并置于10%中性福尔马林固定24 h，10% EDTA(pH值为7.0)脱钙，流水冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，然后制成5 μm 厚连续切片，切片行苏木素—伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色、Masson三色(Masson's trichrome)染色、番红固绿(safranin-fast green,SFG)染色和亚甲基蓝—酸性品红染色，在光学显微镜下观察新生骨组织形成情况.其中，HE染色使细胞质和细胞外基质中的成分着红色，可鉴定骨组织；Masson三色染色区分胶原纤维和肌纤维，可鉴定胶原组织；SFG染色观察软骨组织，可鉴定成骨途径是否是软骨内成骨；亚甲基蓝—酸性品红染色使骨组织染色，可鉴定成骨细胞和新生骨组织.

1.6 统计学分析

每个石蜡块连续切片5张，HE染色切片于显微镜下采图，用Image-Pro plus 6.0软件对其中的新生骨组织面积进行统计，计算每组新生骨组织的面积百分数.所有数据以均数±标准差(x±s)表示，应用SPSS 19.0统计软件进行分析，所有数据采用Student T检验，P<0.05表示差异有统计学意义.

2 结 果

2.1 材料特征

3种生物材料的扫描电镜观察结果如图1所示.

图1 HA、TCP和TSH/TCP 3种材料的扫描电镜观察结果

由图1可见，HA材料硬度较大，孔隙率低，孔与孔之间互不连通；β-TCP材料硬度低，孔隙率较高，孔之间相互贯通，难以用作承重的骨移植材料；TSH/TCP复合材料，孔较多，孔隙率高，孔径范围在100 μm左右，能为纤维组织和骨组织提供通过和生长空间，起到骨组织的修复作用，且有TSH附着于材料中，起到塑形作用，大孔与小孔之间相连，更有利于血管的渗透，为新骨的生成提供营养.研究表明，人工骨的孔径在15～40 μm之间时，纤维组织可以长入骨组织内部；当孔径范围在45～100 μm时，非矿物的骨样可以长入骨内部；而当孔径在150 μm时，骨组织可以长入材料内部[9].TSH/TCP邵氏硬度为62，硬度较HA和β-TCP大，具有良好的力学性能.

2.2 成骨性能比较

3种生物材料的HE染色结果如图2所示.

注：三种生物材料细胞核呈蓝色，骨组织、细胞质、肌纤维和胶原纤维呈深浅不一的红色.

图2 HA、TCP和TSH/TCP HE染色结果

图2结果显示，HA组中，未观察到任何新生骨组织，仅有大量新生血管、纤维结缔组织和间充质组织；β-TCP组中，新生骨组织在材料边缘连片生长，这些新生骨组织已成熟为板层骨，材料内部有大量纤维结缔组织长入；TSH/TCP 组中，大量新生编织骨组织遍布在材料中，成骨细胞镶嵌在骨陷窝里，同时，骨组织周围可见水凝胶附着在边缘，有向材料内部长满的趋势.

2.3 骨组织鉴定

为鉴定TSH/TCP材料中形成的异位骨组织，进行了Masson三色染色、番红固绿染色和亚甲基蓝—酸性品红染色，结果如图3所示.

注：Masson三色染色中，胶原纤维呈蓝色，细胞核呈深蓝色；番红固绿染色中，细胞浆、肌肉、胶原纤维及骨组织呈灰绿色，细胞核呈灰黑色；亚甲基蓝—酸性品红染色中，成骨细胞为深蓝色，细胞基质为淡蓝色，类骨质成紫灰色.

图3骨组织鉴定结果

图3结果显示，成骨细胞沿着骨组织线性排列，骨陷窝镶嵌在骨组织中，骨组织中的胶原纤维排列有序，两种染色均未发现软骨组织，表明材料诱导的异位骨组织是通过膜内成骨形成的.

2.4 新骨面积百分数

3种生物材料的新骨面积统计结果如表1所示.

表1 新骨面积百分数

从表1数据可以看出，HA组中没有任何骨组织形成，TCP组中新骨面积百分数为(10.47±1.57)%，TSH/TCP组中新骨面积百分数为(8.30±1.38)%，P>0.05，两组没有明显的统计学差异，表明TSH/TCP生物材料的成骨能力与TCP相当.

3 结 论

本研究所采用的TSH在温度低于相转变温度(25±2)℃时，聚合物可溶于水形成自由流动液体，而当温度升高至相转变温度以上，聚合物的水溶液形成凝胶形状，凝胶形成的过程是可逆的，是一种良好的黏合材料，将其与TCP混合制备成TSH/TCP复合材料可提高TCP的硬度，并增加材料的弹性.目前，生物材料在大动物体内诱导异位骨形成的现象已被大量报道，而小鼠体内的骨诱导现象仅有零星的报道[10-11].本研究证实了，不管是传统的TCP材料，还是新型的TSH/TCP材料，均能在小鼠体内诱导异位骨形成，此为探讨骨诱导的机制提供了相关线索.同时，本研究还证明了，TSH/TCP材料不仅是一种具有良好的生物相容性、生物降解性和骨诱导能力的复合材料，而且制备方法简单，应用时可按实际需要任意塑形.研究表明，TSH/TCP材料还具有与TCP材料相当的成骨能力，且有更强的硬度和更好的弹性，有望作为一种新型人工骨修复材料.