邻苯二甲酸酯污染对黑土转化酶与脲酶反应动力学的影响

陈文晶，王志刚，徐伟慧，刘泽平，吕智航，王春龙

(齐齐哈尔大学 生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

邻苯二甲酸酯(phthalate esters， PAEs)被用作化学增塑剂[1]，在塑料制品中PAEs的含量高达80%[2]。2011年，中国PAEs消费量达到220万t[3]。PAEs是半挥发性化合物[4]，通过相对较弱的化学键(氢键或范德华力)连接塑料。随着塑料工业的发展和PAEs的广泛使用，有关PAEs污染和健康风险的报道越来越多，空气、水、沉积物、土壤和食物中均有检测到PAEs存在的报告[5-11]。PAEs是具有致畸、致癌、致突变作用，和内分泌干扰性质的化合物[12]，因此，美国国家环境保护局和中国环境监测中心均将邻苯二甲酸二甲酯(dimethyl phthalate， DMP)、邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate， DBP)等PAEs列为优先控制的污染物[13]。

东北黑土在确保国家粮食安全方面具有重要的作用[14]。原始黑土土质肥沃，但近几十年来，由于农药和化肥过度施用，以及薄膜覆盖，PAEs持续进入土壤环境，造成了一系列农业生态问题。土壤酶通常被认作是土壤质量指标之一，也是微生物群体代谢状态、土壤化学和物理条件的重要“传感器”[15]。土壤脲酶、转化酶在土壤养分与有机质转化过程中起关键作用[16]，相比土壤其他物理化学指标，其对外源刺激更加敏感[17]，因此可以反映不同生态系统的土壤污染水平。

在东北黑土中，PAEs类污染物被广泛检出[18]，改变了黑土微生物群落与功能[19]，然而其对黑土酶促反应动力学的影响尚不清晰。故采用非缓冲液法，以东北黑土为供试土壤，PAEs中侧链较短和侧链较长的DMP和DBP为代表，研究其对黑土中脲酶和转化酶活性及酶促反应动力学的影响，以期为环境保护和监测提供理论基础及技术指导。

1 材料与方法

1.1 实验材料

DMP和DBP(纯度>99.5%)购自天津市光富精细化工研究所。

供试黑土采自黑龙江省克山农场(125°39292′N，48°304171′E)，系未污染土样。多点混合取样法采集0～20 cm土样，剔除石块、草根等杂物后混匀，室温风干，过3 mm尼龙筛备用。供试土壤的理化性质：总有机碳2.68%，阳离子交换量46.8 cmol·kg-1，土壤pH值6.3。

1.2 实验设计与指标检测

1.2.1 PAEs污染对土壤酶活的影响

向5 g土样中添加5 mL不同浓度(0、5、10、20、40 mg·kg-1)的PAEs溶液，混匀维持30 min后，加入15 mL 8%蔗糖溶液、5 mL H2O、0.5 mL甲苯，摇匀，37 ℃培养。定期取样，采用3，5-二硝基水杨酸法测定转化酶活性[20]，以生成葡萄糖的量表示。具体地：加入3 mL 0.022 mol·L-13， 5-二硝基水杨酸，沸水浴加热5 min，取出后冷水浴冷却至室温，540 nm波长处比色。每个处理重复3次，并设无底物、无土壤处理作为对照。

向5 g土样中添加5 mL不同浓度(0、5、10、20、40 mg·kg-1)的PAEs溶液，混匀维持30 min后，加入10 mL 0.1 mol·L-1的尿素溶液、20 mL H2O、0.5 mL甲苯，摇匀，37 ℃培养。定期取样，采用靛酚蓝比色法测定脲酶活性[20]，以生成NH3-N的量表示。具体地：加入3 mL 0.012 mol·L-1次氯酸钠和4 mL 0.27 mol·L-1苯酚钠，显色20 min后定容，578 nm波长处比色。每个处理重复3次，并设无底物、无土壤处理作为对照。

1.2.2 PAEs污染对土壤酶促反应动力学的影响

向5 g土样中添加5 mL不同浓度(0、5、10、20、40 mg·kg-1)的PAEs溶液，混匀维持30 min后，加入15 mL不同浓度(0.010、0.025、0.050、0.100 mo1·L-1)的蔗糖溶液、5 mL H2O、0.5 mL甲苯，37 ℃培养，定期取样，测定转化酶活性。

向5 g土样中添加5 mL不同浓度(0、5、10、20、40 mg·kg-1)的PAEs溶液，混匀维持30 min后，加入10 mL不同浓度(0.010、0.025、0.050、0.100 mo1·L-1)的尿素溶液、20 mL H2O、0.5 mL甲苯，37 ℃培养，定期取样，测定脲酶活性。

1.3 指标测定

1.3.1 定浓抑制率

定浓抑制率(I)的计算公式为

(1)

式(1)中：y为PAEs处理下的酶活性；yc为未经PAEs处理的酶活性。

1.3.2 EDx值

根据土壤酶活性和PAEs浓度作线性回归，由拟合方程计算生态剂量(ED10)，表示酶活性降低10%时的PAEs浓度，并将其作为表征土壤轻度污染的指标。

1.3.3 酶促反应动力学参数

酶催化活性(V)的特征由米氏方程描述：

(2)

式(2)中：米氏常数Km值通常表征酶与底物结合的牢固程度，μmol·L-1；最大反应速度Vmax是总酶量的量度，可表征酶-底物复合物分解为酶和产物的速率，μmol·L-1·g-1·h-1[21]；s代表底物浓度，mol·L-1。

1.4 数据分析

所有数据在Excel上进行整理，在SPSS 22.0上进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 PAEs污染对黑土中酶活性的影响

2.1.1 转化酶

由表1可知，随着PAEs浓度升高，转化酶定浓抑制率增大，说明黑土中转化酶活性受到PAEs持续增加的抑制作用。根据DMP、DBP对黑土中转化酶活性的影响进行回归分析，计算得出黑土中转化酶的生态剂量ED10分别为24.352和16.911 mg·kg-1。

2.1.2 脲酶

由表2可知，随着PAEs浓度升高，脲酶定浓抑制率增大，说明黑土中脲酶活性受到PAEs持续增加的抑制作用。根据DMP、DBP对黑土中脲酶活性的影响进行回归分析，计算得出黑土中脲酶的生态剂量ED10分别为5.015和8.677 mg·kg-1。

2.2 PAEs污染对黑土中酶促反应动力学的影响

2.2.1 转化酶

表1不同浓度PAEs对黑土中转化酶活性及定浓抑制率的影响

Table1Effect of different concentrations of PAEs on invertase activity and concentration inhibition rate in black soil

污染物浓度Pollutant concentration/(mg·kg-1)DMP酶活Enzyme activity/(μg·g-1·h-1)定浓抑制率Concentration inhibitionrate/%DBP酶活Enzyme activity/(μg·g-1·h-1)定浓抑制率Concentration inhibitionrate/%011943.030±0.018 a0 b11943.030±0.018 a0 b511912.727±0.019 b0.254 a9956.162±0.004 b16.636 a1011685.455±0.013 b2.157 a9211.212±0.018 b22.874 a2010617.273±0.012 b11.101 a8784.444±0.014 b26.447 a4010094.545±0.020 b15.478 a8562.222±0.005 b28.308 a

表中同列数据后无相同小写字母的表示差异显著(P<0.05)。下同。

Data followed by no same letters indicated significant difference atP<0.05. The same as below.

表2不同浓度PAEs对黑土中脲酶活性及定浓抑制率的影响

Table2Effect of different concentrations of PAEs on urease activity and concentration inhibition rate in black soil

污染物浓度Pollutant concentration/(mg·kg-1)DMP酶活Enzyme activity/(μg·g-1·h-1)定浓抑制率Concentration inhibitionrate/%DBP酶活Enzyme activity/(μg·g-1·h-1)定浓抑制率Concentration inhibitionrate/%0141.279±0.028 a0 b141.279±0.028 a0 b599.876±0.023 b29.306 a100.500±0.022 b28.864 a1060.436±0.013 b57.611 a82.186±0.007 b41.827 a2058.474±0.016 b58.611 a76.023±0.005 b46.189 a4011.446±0.010 b91.898 a66.721±0.006 b52.774 a

由表3可知，PAEs使黑土中转化酶酶促反应动力学参数Vmax和Km降低，属于反竞争抑制机制[22]，即PAEs刺激了转化酶与底物的亲和力，但是削弱了酶-底物复合物分解为酶和产物的速率。

2.2.2 脲酶

由表4可知，PAEs使黑土中脲酶酶促反应动力学参数Vmax和Km降低，属于反竞争抑制机制，即PAEs刺激了脲酶与底物的亲和力，但是削弱了酶-底物复合物分解为酶和产物的速率。

表3PAEs对黑土中转化酶动力学参数的影响

Table3Effect of PAEs on invertase kinetic parameters in black soil

污染物浓度Pollutant concentration/(mg·kg-1)DMPKm/(μmol·L-1)Vmax/(μmol·L-1·g-1·h-1)DBPKm/(μmol·L-1)Vmax/(μmol·L-1·g-1·h-1)00.0217.2250.0217.22550.0145.6950.0236.609100.0115.1490.0175.787200.0135.2220.0165.565400.0124.9460.0145.071

表4PAEs对黑土中脲酶动力学参数的影响

Table4Effect of PAEs on urease kinetic parameters in black soil

污染物浓度Pollutant concentration/(mg·kg-1)DMPKm/(μmol·L-1)Vmax/(μmol·L-1·g-1·h-1)DBPKm/(μmol·L-1)Vmax/(μmol·L-1·g-1·h-1)00.1060.4560.1060.45650.0370.1330.0340.409100.0270.0540.0230.254200.0170.0400.0150.154400.0050.0180.0120.133

3 讨论

研究显示，黑土中DBP的残留量为2.75～14.62 mg·kg-1[23]，不同季节黑土中PAEs的总体含量在1.37～4.90 mg·kg-1[18]。随检测方法、检测时间，以及检测位点不同，土壤环境中PAEs的残留量检测差异很大，因此，本实验中PAEs的处理浓度设定为0、5、10、20、40 mg·kg-1。

土壤酶是土壤的重要生化部分，催化了土壤中众多重要的生化反应，在物质转化、能量代谢、污染土壤修复等过程中发挥着重要作用[24-25]。同时，土壤酶对土壤污染很敏感，可以作为环境污染的检测指标[26]，如芳基硫酸酯酶活性可以表征土壤中阿魏酸的含量[27]，脲酶活性可表征土壤一氯苯污染程度[28]。在本研究中，DMP污染黑土中转化酶和脲酶的ED10分别为24.352和5.015 mg·kg-1，DBP污染黑土中转化酶和脲酶的ED10分别为16.911和8.677 mg·kg-1。根据ED10值越小越敏感的原则，判定黑土中脲酶对PAEs污染比较敏感，可将脲酶活性作为PAEs污染黑土的生化指标。

酶促反应动力学是研究土壤酶促反应机制的重要手段之一，经典的稳态动力学可用来描述土壤中催化反应的进程，有助于了解土壤酶的作用机理[29]。研究显示：随着草甘膦浓度的增大，Vmax、Vmax/Km及K值增大，说明草甘膦的加入增加了转化酶酶促反应的初速度，进而激活了转化酶的活性[20]。一氯苯对碱性磷酸酶的作用机制为非竞争性抑制[28]，邻二氯苯对塿土转化酶的作用机制以非竞争性抑制为主[29]。但本研究显示， PAEs使黑土中转化酶和脲酶酶促反应动力学参数Vmax和Km降低，属于反竞争抑制机制，即PAEs刺激了脲酶和转化酶与底物的亲和力，但是削弱了酶-底物复合物分解为酶和产物的速率，从而抑制其酶活性。