高效污泥降解菌种的筛选及在污泥堆肥中的效果

阮馨怡，刘 曦，关 玥，孔海南，林 燕

(上海交通大学 环境科学与工程学院，上海 200240)

随着我国城镇化水平不断提高，污水处理设施建设高速发展，截至2015年7月，我国城镇污水日处理能力已达到1.70亿 t[1]。一般情况下，污水处理厂每处理1万t生活污水可产生污泥5～8 t，每处理1万t工业污水可产生污泥10～30 t。考虑到工业废水和生活污水未来排放量变化，预计到2020年我国污泥产量为8 382万t[2]。然而，我国污泥无害化处理率至今依然较低，大量污水厂仍采取直接倾倒或简单填埋的手段处理污泥，未经处理的污泥不仅对生态环境构成严重威胁，而且大量占用有限的土地资源。厌氧消化可对大量集中的污泥进行处理，且在处理过程中能达到能量回收和降低环境危害的目的，日渐发展成为污泥稳定化及资源化处置过程中广泛应用的方法。

我国有250余万个自然村，其污水排放量约占我国生活污水总排放量的55%。然而，村镇污水来源分散、难于集中，只能通过建设小规模污水处理设施进行处理，但大量分散的污泥无法使用厌氧消化的方法进行集中处理。现有的针对小规模污泥进行处理的方法有深度脱水工艺、加钙干化工艺和好氧堆肥3种技术路线[3]，其中，深度脱水工艺和加钙干化工艺都需要对现有污水处理厂进行改造，成本较高，相对而言，堆肥方法经济、简便，且能够同时达到污泥处理资源化、无害化的目的，具有良好的发展前景。

高温菌在高温条件下降解酶活性高、代谢能力强，能缩短生物转化的周期，提高有机质降解效率[4]，在污泥降解转化生产有机肥领域具有巨大的经济效益和潜能。本研究从采集的样品中筛选能在高温条件下有效降解污泥的菌株，按照一定比例相互混合，研制复合微生物菌剂，用于污泥的高温堆肥处理，进行好氧堆肥试验，并设置空白对照组，定期检测堆体中温度、pH、含水率、有机质含量和种子发芽指数等指标，旨在提高污泥的降解能力，并将其转化为高质量的有机肥，为微生物菌剂在污泥堆肥中的应用提供一定的参考依据与菌种资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种来源

试验所用菌种分别采自某地的高温土壤(编号T1～T3)、污水处理厂的脱水污泥(编号W1～W5)、堆肥高温期的物料(编号G1、G2)和经过65 ℃好氧堆肥后的腐熟物料(编号F1、F2)。

1.1.2 培养基

LB培养基：胰蛋白胨 10 g·L-1，酵母提取物 5 g·L-1，氯化钠 10 g·L-1，121 ℃灭菌20 min。

分离培养基：脱水污泥(含水率83%)100 g·L-1，琼脂18 g·L-1，121 ℃灭菌20 min。

1.1.3 堆肥原料

堆肥原料为某污水处理厂脱水污泥和锯末，具体性质见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株分离、纯化

取20 g菌源样品于盛有100 mL无菌水的250 mL锥形瓶中， 200 r·min-1振荡20 min，静置30 min，得到上清液。取上清液涂布于分离培养基，将平板倒置于55 ℃的恒温培养箱培养48 h。长出菌落后，进行多次平板划线直至纯化。筛选得到的菌株于相应的试管中斜面4 ℃保存。

1.2.2 菌株制备

在250 mL锥形瓶中装入配置好的LB培养基，分别接入保存的单菌，贴好标签，55 ℃、150 r·min-1振荡培养24 h，5 000 r·min-1离心10 min。倒掉培养基，加入配置好的质量分数0.85%的生理盐水振荡摇匀，离心。重复清洗3次后，用超纯水代替生理盐水再进行该步骤，离心后收集菌体备用。

1.2.3 菌株筛选

以脱水污泥为主材料，根据C/N，配一定质量的锯末制成堆肥原料(C/N在25～30之间，水分含量在60%左右)，充分混匀后，分装于250 mL锥形瓶中，每瓶20 g。按5%接种量接种各菌株，55 ℃、170 r·min-1振荡5 d。测定污泥有机质降解率和水分去除率，同时设置不接种菌株组作为空白对照，筛选出降解效率高的菌株。

表1堆肥原料成分

Table1Main composition of composting raw materials

试验材料Experimental materials含水率Water content/%pH有机碳Organic carbon/%全氮Total nitrogen/%C/N脱水污泥 Dehydrated sludge78.157.6735.304.877.25锯末Sawdust27.367.4645.470.35131.78

将筛选出的4株降解率较高的菌株，按照等比例分别进行两两组合、三者混合或全混合，统一采用5%的接种量，同前述方法，筛选出降解效率高的菌株组合。

1.2.4 菌株鉴定

菌株的形态及生理生化鉴定方法参考《微生物学实验》[5]和《常见细菌系统鉴定手册》[6]。对菌株进行生物学鉴定，待测目的菌株以菌液为模板，采用通用引物27F/1492R进行16S rDNA的PCR扩增。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共24个循环；72 ℃保持10 min，10 ℃终止。将扩增后的PCR产物送上海美吉生物公司测序，测序结果提交NCBI数据库，并利用Blast程序与基因库中的16S rDNA序列进行比对分析，对各菌株进行初步鉴定。

1.2.5 污泥高温堆肥试验

以脱水污泥为主要材料，加入锯末调节初始含水率至60%左右、C/N在25～30之间。以1.2.3节选定的菌株组合作为试验材料，分别按照质量分数3%、5%和10%的比例添加于堆体中，并设置不加菌种组合的空白组，每个堆体3.5 kg，其他试验条件相同。试验持续21 d，每2 d翻堆1次。每天测定堆体温度，同时记录室温。每隔1 d取样，测定含水率、pH值、有机质含量，以及种子发芽指数。

1.2.6 指标测定

温度采用水银温度计进行测量；含水率采用烘箱干燥法测定，105 ℃烘干至恒重；pH值参照NY 525—2012中方法测定；种子发芽指数参照GB/T 23486—2009中方法测定；有机质含量参照文献[7]方法测定。

2 结果与分析

2.1 菌株分离筛选

2.1.1 单菌株降解效果比较

由图1可知，经过5 d的降解，空白组有机质降解率为22.37%，投加外源菌的各试验组的有机质去除率均高于空白组，其中，有机质去除率最高的菌株为W4(近50%)，其次是T1、T2和G1，有机质去除率都在35%左右，剩余菌株的有机质去除率均在30%左右。相对于张小娟等[8]模拟堆肥5 d最高24.7%的有机质降解率，本试验供试菌株的有机质降解率均在较高水平。W4菌株的有机质降解率最高，这可能是因为其分离自脱水污泥，更适应于污泥环境。T1、T2和G1菌株均分离自55 ℃以上的高温环境，因此在试验条件下也较适应，但对污泥中有机质的降解能力不如W4。

与有机质去除率的结果类似，投加外源菌的各试验组的水分去除率也都高于空白组，水分去除率最高的菌株同样为W4，去除率23.37%，是对照组的1.9倍，G1、T1和T2菌株试验组的水分去除率在16%左右，约为对照组的1.3倍。王亮等[9]堆肥试验5 d的最高水分去除率为14.8%，与之相比，本试验中供试菌株的水分去除率亦较高。

对比水分去除率和有机质降解率的结果发现，两者变化趋势一致，即有机质降解率越高的处理，其水分去除率也相对越高。这可能是由于微生物降解有机质的过程中释放的热量使水分挥发，有机质降解越多，产生的热量越多，对水分去除的作用亦越强。综合前述试验结果可知，G1、T1、T2、W4是本次试验分离鉴定出的优势菌，其中，以W4菌株对污泥的有机质降解率最高。

2.1.2 菌株组合降解效果比较

单一的细菌、真菌、放线菌群体，无论其活性多高，在加快堆肥化过程中的作用都比不上混合微生物菌群的共同作用[10]。从图2可知，各菌种组合中，有机质去除率最高的为H11处理，即将G1、T1、T2、W4以1∶1∶1∶1的比例混合，在试验条件下有机质去除率高达55.69%，是空白对照组的2.63倍。H7处理的有机质降解率也较高，与H11处理接近。水分去除率最高的处理同样为H11，去除率达26.98%，是空白对照组的2.16倍，其次是H7处理，去除率25.51%。

与单菌株试验结果相比，H11处理的有机质降解率和水分去除率提升进一步提高，效果更佳。

2.2 菌种鉴定

对筛选出的4株菌(G1、T1、T2、W4)进行菌落形态和个体形态鉴定。上述4株菌在55 ℃下培养24 h，在固体培养基中均形成乳白色不透明菌落，显微镜下观察为单独杆状菌。G1菌落假根状，边缘丝状，表面扁平，较干燥。T1菌落假根状，边缘丝状，表面凹陷，光滑，较干燥。T2菌落圆形，边缘丝状，表面隆起，粗糙，较干燥。W4菌落圆形，边缘波状，表面凸透镜状，光滑，较干燥。

图1 不同菌株在污泥模拟堆肥条件下的有机质降解率和水分去除率Fig.1 Degrading rate of organic matter and water removal rate of different strains under simulated sludge composting

H1， G1T1; H2， G1T2; H3， G1W4; H4， T1T2; H5， T1W4; H6， T2W4; H7， G1T1T2; H8， G1T1W4; H9， G1T2W4; H10， T1T2W4; H11， G1T1T2W4.图2 不同菌株组合在污泥模拟堆肥条件下的有机质降解率和水分去除率Fig.2 Degrading rate of organic matter and water removal rate of different strain combinations under simulated sludge composting

由表2可以看出，4株菌均为革兰氏阳性菌，细胞壁厚，在面对不良生存条件下，可更好地保持细胞外形，抑制机械和渗透损伤从而保护细胞。G1菌株的甲基红试验结果为阴性，与葡萄糖氧化发酵实验结果为产碱菌株相对应，而T1、T2和W4菌株均能分解葡萄糖产酸，甲基红试验结果为阳性，并与葡萄糖氧化发酵试验结果为发酵菌株相对应。4株菌均能水解淀粉，产硫化氢，这也是菌落形成过程中闻到轻微臭味的原因，不过味道较轻，不影响后续使用。4株菌均不能分解纤维素或使明胶液化，说明菌株在遇到纤维素、蛋白质大分子有机物时，仍需与其他微生物配合进行作用。

对4株菌进行16S rDNA分析，结果显示，G1、T1、T2、W4分别与嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusthermoamylovorans)、嗜热芽孢杆菌(Bacillusthermolactis)、芽孢杆菌(Bacillussp. TAT112)、芽孢杆菌(Bacillussp. HR1)的一致性均达到99%， 4株菌均属于芽孢杆菌属(Bacillus)。

2.3 污泥高温堆肥试验

2.3.1 堆肥过程中堆体温度的变化

堆肥温度变化能够反映不同阶段微生物的代谢活性，是堆肥过程最直观也是最重要的参数，也是决定堆肥能否顺利进行并完成的重要因素。由图3可知，4个处理堆体的变化趋势一致。整个堆肥过程可以根据温度不同分为3个阶段：0～2 d，升温阶段；2～4 d，高温阶段；4～21 d，降温阶段。在适宜的含水率、C/N和氧气浓度下，微生物通过分解有机物产生大量的热量，使堆体迅速升温，在堆肥的第2天，加入菌株组合的3个堆体温度迅速升高，达到55～63 ℃，其中，以添加3%菌株组合的处理堆温最高(63 ℃)，随着菌株组合添加量的提高，堆体所达到的最高温度降低。这可能是由于所加入的微生物量过多，与污泥中的土著微生物形成竞争关系，无法维持菌种之间的生态平衡，或者是由于加入的微生物之间因生存竞争而大量死亡所致[11]。空白组的最高堆温虽然也达到了53 ℃，但升温幅度明显低于加入处理组。加入菌株组合的3个堆体堆温在55 ℃以上维持4 d，能够起到杀灭致病微生物的作用。堆肥21 d后，4个堆体的温度趋于稳定，较接近环境温度，说明堆肥过程结束。总体来看，加入微生物菌株组合可以提高堆肥升温速率和最高温度，延长高温期。

2.3.2 堆肥过程中堆体含水率的变化

表2菌株生理生化特征

Table2Physical and biochemical character of strains

检测指标Measurement index菌株StrainG1T1T2W4革兰氏染色Gram stain++++甲基红试验Methyl red test-+++乙酰甲基甲醇试验Voges-Proskauer test----淀粉水解试验Starch hydrolysis test++++柠檬酸盐试验Citrate test----明胶液化试验Gelatin liquefaction test----葡萄糖胺试验Glucosamine test+--+纤维素分解试验Cellulose decomposition test----葡萄糖氧化发酵试验Glucose oxidative fermentation test产碱Alkali-producing发酵Fermentation发酵Fermentation发酵Fermentation产硫化氢试验Hydrogen sulfide production test++++半固体穿刺试验Semi-solid puncture test无None扩散Diffused扩散Diffused扩散Diffused

+表示阳性，-表示阴性。

+ indicated positive; - indicated negative.

水分是影响堆肥物料腐熟速度的重要参数，合适的水分是保持微生物最佳活性的必要条件。由图4可知，4组堆体的含水率均呈下降趋势，接种菌株组合的堆体含水率下降速度明显快于空白组，尤其在前3 d表现较为突出，之后变化较为平缓。各处理中，以3%添加量的堆体效果最好，含水率下降了18.9%，是空白组的1.45倍，高于张小娟等[8]堆肥中10.27%的水分去除率。微生物在分解有机物的同时产生大量热量，使堆体温度升高，加快了水分散失[12]。空白组的含水率也呈下降趋势，是污泥中本身所含微生物所致，但由于土著微生物在堆肥过程中活性较差，整体的含水率变化较为平缓。

2.3.3 堆肥过程中堆体pH的变化

图3 堆肥过程中堆体温度的变化Fig.3 Dynamics of temperature during composting

图4 堆肥过程中堆体含水率的变化Fig.4 Dynamics of water content during composting

堆肥过程中堆体微生物的有机降解活动，需要在一个适宜的酸碱条件下进行。研究认为，堆肥最适宜的pH范围为5.5～8.0，由图5可知，4个堆体的pH值均处于此范围之内，且均呈现先上升后下降的趋势，与弓凤莲等[13]研究结果一致。这是由于：堆肥初期微生物氨化作用分解含氮化合物，产生大量不能及时挥发的氨气，导致物料的pH增大；堆肥后期氨化作用减弱，而硝化作用增强，同时有机物分解产生有机酸，故致pH下降。对照图3可以看出，高pH环境的维持时段与高温维持时段基本一致，都是由微生物分解有机物造成的，该时段正值微生物，尤其是嗜热微生物的活跃期。3%添加量的堆体温度最高，但其堆体pH值并未明显高出其他堆体，这有利于减少堆肥过程中NH3的挥发，保持堆肥肥效。

2.3.4 堆肥过程中堆体有机质含量的变化

堆肥过程中有机物在微生物的作用下会分解为CO2、水等小分子物质，同时又会合成新的物质——腐殖酸，所以在堆肥过程中，有机质的含量是不断减少的。从图6可以看出，4个堆体的有机质含量均呈现整体下降趋势，加入菌株组合的处理相对于空白组，其有机质含量在初始情况下变化幅度小。这可能是由于加入微生物菌株组合后，需要与污泥中原有的微生物群落进行相互适应。加入微生物菌株组合的堆体在整个堆肥过程中有机质降解率波动较小，相对稳定。在整个堆肥过程中，4个堆体中的有机质都得到了有效的分解，最终的有机质含量在74%～78%。其中，3%添加量堆体的有机质含量在21 d内由最初的87.9%下降到74.85%，高于宫晓梅等[14]和孙干等[15]试验结果，说明选定的微生物菌株组合可以加快堆体中有机物的分解。

2.3.5 堆肥过程中堆体种子发芽指数的变化

种子发芽指数是表征堆肥有无毒性的重要指标，种子发芽率越高则堆体毒性越小，腐熟度越好。一般情况下，种子发芽指数大于80%可认为堆肥达到完全腐熟，对种子基本无毒性[16]。由图7可知，添加微生物菌株组合的堆体，种子发芽指数呈稳定增长趋势，添加3%、5%、10%菌种组合的堆体自15 d起，其种子发芽指数陆续达到80%以上，达到完全腐熟，堆肥结束时，其种子发芽指数分别为134.10%、118.58%、103.36%，以3%添加量处理的种子发芽指数最高，堆体毒性最小，而空白组最终种子发芽指数低于50%，未达到腐熟标准。这说明选定的微生物菌株组合能快速有效地分解有毒物质，缩短堆肥周期。

图5 堆肥过程中堆体pH的变化Fig.5 Dynamics of pH during composting

图6 堆肥过程中堆体有机质含量的变化Fig.6 Dynamics of organic matter content during composting

图7 堆肥过程中堆体种子发芽指数的变化Fig.7 Dynamics of germination index during composting

3 小结

本研究共筛选出4株污泥高效降解菌株，经鉴定，均属于芽孢杆菌属(Bacillus)，将其以相同比例混合，并以不同剂量添加至污泥堆肥中，结果表明，当添加量为3%时，堆肥效果最优，堆温升高，高温期延长，且堆肥周期缩短，所选定的菌株组合在污泥堆肥中有一定的应用潜力。