思茅松遗传作图群体选择

王大玮，唐红燕，段安安，周 军，汪元超，蔡年辉，许玉兰，李思广

思茅松(Pinus kesiya var.langbianensis)是我国云南省特有树种，是针叶树种中最速生的种类之一，是一种以用材为主并具有多种用途的植物，有很高的开发利用价值［1-2］。其木材广泛用于建筑、造纸、家具制造等行业，富含优良品质的松脂，思茅松松脂是我国最重要的松脂资源之一［3-5］。

遗传连锁图谱的构建成为现代遗传学研究中一个非常重要且应用较为广泛的领域［6］，同时还是实现分子标记辅助育种与数量性状定位的必要手段［7-8］。作图群体的建立不但为遗传作图提供了研究材料，而且是构建遗传图谱的关键步骤［9］。SRAP分子标记技术凭借其简便、稳定的特点，目前已广泛应用于植物的遗传相似系数的分析研究中［10-11］。近年来，随着分子标记技术的发展各类植物的遗传作图群体相继建立［12-16］，为这些植物的遗传图谱构建和数量性状定位奠定了坚实的基础。

在对思茅松进行人工杂交和苗木培育的基础之上，测定杂交后代各单株的田间表型性状，并结合亲本SRAP标记分析，选择出子代在田间表型性状和亲本在DNA多态性水平上差异均较大的分离群体，从而为今后思茅松遗传连锁图谱的构建以及进行相关重要性状定位提供了研究材料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 杂交亲本 从性状差异较大的11个思茅松优良无性系中各选择1株作为杂交亲本。其中父本5株:JG1(高产脂)、NR7(速生高产)、LC3(高产脂)、ZY1(速生高产)、PW2(高产脂);母本 6株:PW12(速生高产)、LC9(速生高产)、JG7(高产脂)、JD5(高产)、PW3(速生)、SM11(速生)。

1.1.2 杂交F1群体 将11个茅松优良无性系按照析因交配设计，共组成了30个杂交组合进行人工杂交，利用播种育苗的方法对所获得的杂交种子进行繁殖，通过培育最后得到了9个较大的F1全同胞家系，分别命名为1～9号家系(表1)。获得家系编号，括号内为群体数量。

表1 F1家系来源及编号Table 1 Number of F1families

1.2 方法

1.2.1 田间表型性状的调查及分析 1年生苗木高生长停止时，对9个F1家系每株测定其田间表型性状。测定性状包括苗高生长量、地径生长量、针叶长、针叶粗、叶梢长、针叶长/针叶粗、针叶长/叶梢长。对9个F1家系的各性状数据进行整理，利用SPSS13.0软件对各家系的表型数据进行统计分析，并计算变异系数。

1.2.2 亲本SRAP分析 采集11个亲本的幼嫩针叶，利用改良的CTAB法对思茅松基因组DNA进行提取。根据已建立的SRAP反应体系［1］，在100对引物组合(表2)中筛选出15对引物组合对亲本进行多态性检测，引物组合分别为:Me1-Em4、Me2-Em9、Me4-Em9、Me5-Em10、Me6-Em2、Me6-Em3、Me6-Em5、Me6-Em9、Me7-Em1、Me7-Em7、Me8-Em4、Me9-Em6、Me9-Em7、Me9-Em9、Me10-Em3。在思茅松SRAP聚丙烯酰胺电泳图谱上选择清晰可见且可重复的条带，转换为“0”、“1”矩阵，利用 NTSYS pc version 2.10e软件对各亲本间的遗传相似系数进行计算和UPGMA聚类分析。

1.2.3 作图群体的选择 在各家系生长性状变异系数分析的基础上，结合11个亲本的SRAP遗传相似系数分析，最后在9个备选群体中选取F1代表型及亲本DNA水平均差异较大的分离群体作为构建思茅松遗传连锁图谱构建的作图群体。

表2 思茅松SRAP引物序列Table 2 Sequences of primers used in SRAP-PCR system

2 结果与分析

2.1 候选作图群体表型性状的变异

由表3可知，9个群体各性状的平均变异系数在 22.47%～34.48%，9 号家系最高，达 34.48%，1、2、5、8号家系的平均变异系数均＞25%，分别排在2～5位，6、4、3、7 号家系的平均变异系数均＜25%，分别排在6～9位。9号家系的地径、针叶粗的变异系数都最大，针叶长及针叶长/针叶粗的变异系数都排在第2，苗高的变异系数第3。排在第2的是平均变异系数为27.09%的1号家系，其针叶长的变异系数最大，苗高的变异系数排在第2，其他指标的变异系数均较小。排在第3的是2号家系，其苗高的变异系数最大，地径、变异系数排在第3，其他性状的变异系数都较低。

表3 不同家系生长性状的变异系数Table 3 Variation coefficient of the growth traits in families %

2.2 亲本SRAP分析

利用SRAP标记对11个杂交亲本进行多态性检测(图1)，15对引物总共扩增出132个位点带数，其中，每对引物扩增出7～12个不等位点条带数，总多态性位点条带数为129个，多态性带比率为95.45%;每对引物平均扩增位点条带为8.8个，其中多态性位点条带的个数是8.4。扩增多态性位点条带数最多的引物对Me9-Em7为12个条带。引物扩增多态性位点条带最少的引物对是Me4-Em9、Me6-Em3、Me6-Em5、Me9-Em9，7 个条带(表4)。

图1 引物组合M9-E7扩增出的SRAP图谱在11个亲本间的多态性分布Fig.1 The SRAP polymorphisms amplificated by primer combination M9-E7 from 11 parents

对11个杂交亲本的遗传相似系数进行分析。结果表明，各亲本间的遗传相似系数 0.471 9～0.854 8(表5)，9个家系亲本间遗传相似系数大小顺序分别为:2号＞3号＞8号＞4号＞6号＞1号＞7号＞9号＞5号。其中2号家系的亲本PW12与PW2间的遗传相似系数最大，为0.854 8，说明2亲本间的亲缘关系较近;5号家系的亲本JG7与ZY1间的遗传相似系数最小，为0.426 1;9号家系的亲本SM11与JG1间的遗传相似系数第二小，为0.471 9。表明这2个组合亲本间的亲缘关系较远。

表4 SRAP引物多态性分析Table 4 Analysis of polymorphism SRAP primers

在此基础上，进行聚类分析绘制遗传聚类图。由图2可以看出，在遗传相似系数为0.577 2的水平上进行划分，11个杂交亲本可分为5组:第1组以JG7单独为1组;第2组SM11单独为1组;第3组NR7号单独为 1组;第 4组以 ZY1、PW2、PW12、PW3这4个亲本成为1组，其中PW2和PW12亲缘关系最近;第5组以JG1、LC3、LC9、JD5这4个亲本成为1组，其中LC3和LC9亲缘关系较近。

2.3 作图群体的选择

9号家系的平均变异系数最高，从田间表型性状变异情况来看是十分理想的候选作图群体，但作图群体的确定，还需要从DNA水平考虑其亲本间的遗传差异。从SRAP标记分析结果来看，5号家系的亲本JG7与ZY1的遗传相似系数最小，但5号家系田间表型性状平均变异系数较低，不是适宜的作图群体。9号家系的亲本SM11与JG1间的遗传相似系数仅次于5号家系，其亲本间的亲缘关系较 远。综合考虑，选择出在F1表型及亲本DNA水平均差异较大的9号家系作为构建思茅松遗传连锁图谱的分离群体。

表5 11个亲本间的遗传相似系数Table 5 Genetic similarity coefficient between 11 parents

图2 11个亲本的遗传聚类图Fig.2 Dendrogram of 11 parents

3 结论

利用11个思茅松优良无性系作为杂交亲本，人工控制授粉后获得了9个较大的分离群体。在对9个思茅松F1家系田间表型性状变异分化程度分析的基础上，进一步利用15对SRAP引物组合对11个亲本间在分子水平的多态性进行了检测，最终选取了子代表型及亲本DNA水平均差异较大的9号家系作为构建思茅松遗传连锁图谱的分离群体。为思茅松遗传连锁图谱构建、重要经济性状的定位和其他分子遗传学方面的研究提供了宝贵的材料。