梅花鹿茸I型胶原对骨质疏松大鼠Wnt/β-catenin信号通路的影响

2018-10-20 06:56石晓征李晓华曲晓波
长春中医药大学学报 2018年5期
关键词:鹿茸成骨细胞型号

石晓征,李 娜,李晓华,曲晓波

(长春中医药大学,长春 130117)

鹿茸是一种极其珍稀名贵的动物药,具有“生精补髓,养血益阳,强筋健骨”之功效[1]。鹿茸中含有包括蛋白质在内的丰富的生物活性物质,其中以胶原蛋白含量最为丰富[2]。胶原蛋白是一种可以构成骨组织的结构蛋白,包括许多种类。 其中I型胶原广泛分布于皮肤、肌腱、骨骼等组织,可维持骨密度,常用于骨代谢性疾病及骨质疏松症的治疗[3]。鹿茸中含有丰富的I型胶原,是其强筋健骨的根本所在。骨质疏松症是一种全身代谢性骨病,临床上在老年人及绝经妇女群体中较为多见[4]。由于外界环境或自身原因导致的骨质量减少和成骨不足,会进一步引起骨微结构破坏和骨脆性的增加,形成骨质疏松。随着我国老龄化现象日趋严重,骨质疏松的发病率也随之大幅提高,严重影响人们的生活质量[5-6]。研究[7]发现,经典的Wnt/β-Catenin 信号通路因参与成骨细胞的增殖、分化过程,并影响其活性和功能,逐渐成为科研人员对防治骨质疏松症药物研究的热门方向。本课题组在此前的研究[8-12]中发现,梅花鹿茸胶原酶解物对其骨质疏松大鼠具有一定的防治作用,并成功从梅花鹿茸胶原酶解物中分离纯化得到梅花鹿茸I型胶原(SDC-I)。因此,本实验在前期工作基础上,进一步观察SDC-I对骨质疏松大鼠的保护作用,并探索其作用机制是否与Wnt/β-Catenin 信号通路的激活相关,为SDC-I对骨质疏松的防治提供实验数据和理论依据。

1 材料与方法

1. 1 动物 健康清洁级Sprague Dawley(SD)大鼠,雌性,50 只,体质量(200 ± 10) g,购自长春市忆斯实验动物技术有限责任公司,合格证号 SCXK(吉)2011-0004。

1.2 药品与试剂 SDC-I(相对分子质量 3.1×104,质量分数56.89%)制备,长春中医药大学分子药理实验室。Trizol,购自美国Invitrogen公司;DNA分子标记,cDNA第一链合成试剂盒,2×SYBR PCR扩增试剂盒均购自北京百泰克公司;溴化乙锭(EB),10×loading buffer购自日本Takara公司;引物合成,安徽通用生物系统有限公司。

1.3 主要仪器 分析天平,型号BT125D ,购自德国Sartorius 公司;冷冻离心机,型号5430R,双能X线骨密度仪,型号DPx-L,购自美国LUNAR公司;PCR仪,型号Mastercycler ,购自德国 Eppondorf 公司;核酸电泳仪,型号Min-Sub ,购自美国 Bio-Rad 公司;制冰机,型号FHB100,购自上海比朗公司;超微量紫外分光光度计,型号Colibei ,购自德国伯赫公司。

1.4 模型建立及分组给药 将50只SD雌性大鼠,随机分为5组:即空白组,模型组,SDC-I低、中、高剂量组。进行7 d适应性饲养,除空白组外,其余各组均进行双侧卵巢摘除手术,建立大鼠骨质疏松模型。空白组和模型组灌胃给药等量生理盐水,SDC-I低、中、高剂量组分别给予0.05、 0.1、0.2 g/kg SDC-I灌胃治疗,每周给药 6 d(每周日停药),连续给药90 d。

1.5 取材方法 给药90 d后,将大鼠禁食1 d。经腹主动脉取血,将血清进行分离后,放入 - 80 ℃冰箱中保存备用。取大鼠右后肢股骨,将其与肌肉等其他组织剥去并碎化后,放入事先准备好的无菌 EP管中,于- 80 ℃保存,备用。

1.6 检测指标

1.6.1 骨密度(BMD)测定 给药前应用X 线骨密度仪检测各组大鼠股骨的 BMD,停止给药后再次检测各组大鼠 BMD,观察给药前后大鼠 BMD变化情况[13]。

1.6.2 最大载荷测定 取各组大鼠左后肢股骨,剔除股骨上的肌肉及其他组织,称重。将取好的各组大鼠股骨置于生物力学测定仪基座上固定。启动仪器,当测定仪前端自动挤压股骨断裂时,记录数值[14]。

1.6.3 血清生化指标测定 应用 ELISA 方法测定各组大鼠血清骨钙素(BGP)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)水平,具体操作步骤均严格按照各个试剂盒的说明书完成,应用酶标仪进行检测。

1.6.4 RT-PCR测定 将保存的各组大鼠股骨从- 80 ℃冰箱中取出,立即浸入液氮中,在液氮保护下,迅速研磨至细粉。应用Trizol法提取各组大鼠骨组织中的总RNA,并利用琼脂糖电泳检测。取适量RNA按照试剂盒说明进行反转录实验,其余样品加入1 mL无水乙醇,- 80 ℃保存备用。设置程序:1)45 ℃,50 min;2)70 ℃,10 min。反应结束后,应用超微量紫外分光光度计检测反转录液中cDNA的浓度。设置RT-PCR反应程序: 95 ℃,起始模板预变性。1)95 ℃,20 s;2)65 ℃,10 s; 3)72 ℃ ,30 s,循环40次,终止反应。以β-actin为内参基因,分析各组样品β-Catenin、LRP5 mRNA的相对表达量,进行差异比较。引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物碱基序列

1.7 统计学方法 采用SPSS 13.0 软件处理数据,并进行Student’s t检验分析,数据以均数±标准差(x± s )表示,以 P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 SDC-I对大鼠体质量、BMD及最大载荷量的影响 见表2。

2.2 SDC-I对大鼠血清生化指标的影响 见表3。

2.3 各组大鼠股骨 β-Catenin、LRP5 mRNA 相对表达量比较 见表4。

表2 SDC-I对大鼠体质量、BMD及最大载荷量的影响(x± s ,n = 10)

表3 SDC-I对大鼠血清生化指标的影响(x± s ,n = 10) ng/mL

表4 各组大鼠股骨 β-Catenin、LRP5 mRNA 相对表达量比较(x± s ,n = 10)

3 讨论

研究[15]表明,Wnt/β-Catenin信号通路的失控和失衡与骨质疏松的发生关系密切。此信号通路可通过更新干细胞、诱导分化、使成骨细胞发生、抑制各类骨组织细胞凋亡等多种方式增加骨量及骨密度[16]。其中,β-Catenin是此信号途径中的最为关键的调控因子,稳定的β-Catenin聚集在细胞质内,当其转移至细胞核内,并与转录因子结合后,方可启动编码成骨细胞的特异性转录因子Runx2的转录,达到调控骨组织细胞分化、发生、促成骨形成的目的。β-Catenin需要通过Wnt与LRP5/6在胞外结合,激发胞内信号转导,从而使GSK-3β磷酸化失活,来维持自身的稳定[17-18]。LRP5作为Wnt信号转导的跨膜受体,不但可以稳定β-Catenin,还可以保护成骨细胞的增殖、功能和存活不受影响,也是骨量形成过程中不可缺失的一环[19]。因此,Wnt/β-Catenin途径是调控成骨细胞和骨形成不可或缺的重要信号转导通路。 当此通路信号传导失控时,将导致包括骨质疏松在内的多种骨骼性疾病的发生[20-21]。

本研究发现,大鼠双侧卵巢切除后,随着大鼠BMD的降低,β-Catenin 和LRP5 mRNA 的表达显著下降;而高剂量的SDC-I能在提高大鼠BMD 、最大载荷量及血清中的BGP水平的同时,有效上调β-Catenin和LRP5 mRNA 的表达。因此,SDC-I防治骨质疏松大鼠的机制可能是通过促进细胞内 β-Catenin 的稳定、集聚、转入到细胞核中,来激活 Wnt/β-Catenin 信号转导途径,促进成骨分化,从而发挥抗骨质疏松作用。后续实验将从去势大鼠骨质疏松模型中分离培养原代成骨细胞,结合基因敲除、miRNA等技术,深入探索SDC-I到底如何通过调控Wnt/β-Catenin信号通路发挥对骨质疏松防治作用,进一步阐明 SDC-I对骨质疏松防治作用的物质基础及分子机制。

猜你喜欢
鹿茸成骨细胞型号
航天型号批生产管理模式的思考
型号产品配套管理模式探索与实践
航天型号全要素管理的初步实践
鹿茸发生与再生
最佳代言
淫羊藿次苷Ⅱ通过p38MAPK调控成骨细胞护骨素表达的体外研究
花鹿茸与马鹿茸的生物活性与应用比较研究
不同型号CTC/TDCS设备的互联互通
土家传统药刺老苞总皂苷对2O2诱导的MC3T3-E1成骨细胞损伤改善
中国鹿茸国际竞争形势与前景分析