中药黑芝麻不同炮制品体外抗氧化作用研究*

刘 君，张丽艳，幕杨娜，张彬彬

1辽宁省中医药研究院，辽宁 沈阳 110034；2辽宁中医药大学基础医学院；3中国人民解放军第201医院

中药黑芝麻始载于《神农本草经》，其药味甘，性平，归肝、肾、大肠经，具有补肝肾，益精血，润肠燥之效。可用于治疗精血亏虚、头晕眼花、耳鸣耳聋、须发早白、病后脱发、肠燥便秘［1］。现代研究［2］表明，黑芝麻及其有效成分芝麻素等有多种药理作用，具有抗氧化、抗衰老、降压作用及促黑素生成等作用。而其药理作用多与其抗氧化作用相关。祖国医学认为，黑芝麻生用及炮制后应用功效有差异。古代医家认为其生用可化痰，凉血解毒。如治疗小儿瘰疬、浸淫恶疮、小儿头疮等。现代常用炒黑芝麻，炒后香气浓，具有补益肝肾、填精补血、润肠通便的功效。主要用于治疗头昏、头痛、眼花、耳鸣、须发早白或脱发、肠燥便秘等［3］。以唐代孙思邈流传下来的以“九蒸九晒”的方法炮制黑芝麻，做成丸，每日服用，久服可明目洞视，肠柔如筋［4］。晋朝葛洪在《抱朴子》中云：“芝麻三斗，蒸熟后晒干，用水淘去沫再蒸再晒，如此反复九次”［5］。古人炮制黑芝麻的工序如此的繁琐，对其功能究竟有何影响，有必要进行深入的研究。本研究对黑芝麻生品、炒制品、九蒸九晒炮制品的提取物进行了体外抗氧化作用研究，并对三者的体外抗氧化作用进行了比较，现报道如下：

1 材料

1.1 药材 黑芝麻生品，购于辽宁省药材公司(市售)，经沈阳药科大学王延年副教授鉴定为黑芝麻(Sesamum indicum L.)。Vc购于上海化学试剂公司。

1.2 仪器与试剂 U-3010型紫外可见分光光度计(日本日立公司)。所用试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 黑芝麻不同炮制品的制备

2.1.1 炒黑芝麻 取黑芝麻生品，按照《中国药典》一部(2015版)清炒法，炒至有爆声，即得。

2.1.2 九蒸九晒黑芝麻 取黑芝麻生品，置蒸锅内，蒸制30分钟，取出，凉晒至干。反复重复9次，即得。

2.2 黑芝麻生品及炮制品提取物的制备 取黑芝麻生品、炒黑芝麻、九蒸九晒黑芝麻粉碎，过40目筛，分别以6倍量95%的乙醇超声提取2次，每次20分钟，3 000 r/min离心，取上清液，合并上清，得乙醇提取物。取残渣干燥，挥尽乙醇，再分别以6倍量的水超声提取2次，每次20分钟，3000r/min离心，取上清液，合并上清，得水提取物。合并水提取物及乙醇提取物［6］。减压回收溶剂，真空干燥后，分别得到生黑芝麻提取物(SHE)、炒黑芝麻提取物(CHE)、九蒸九晒黑芝麻提取物(ZHE)。

2.3 黑芝麻提取物体外抗氧化作用研究 Vc作阳性对照，以蒸馏水稀释成0.3 mg/mL的溶液，于4℃贮存，备用。

2.3.1 DPPH自由基清除能力的测定 二苯基苦味肼自由基(DPPH·)是一种稳定的以氮为中心的自由基，其乙醇溶液呈紫色，在波长517 nm处有强烈吸收。在有自由基清除剂存在时，DPPH的孤对电子被配对，从而使其褪色，褪色程度与其接受电子呈定量关系，因而可用比色法进行定量分析［7］。将样品SHE、CHE、ZHE用甲醇分别配制成相当于含生 药 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL 溶液。DPPH用无水乙醇配制成2×10-4mol/L的溶液。准确吸取样品待测溶液、DPPH溶液各2 mL，混匀后室温下放置30分钟，于波长517 nm处测定吸光度得Ai，每个样品平行测定3次，取平均值。以Vc作为阳性对照，以无水乙醇代替DPPH测定吸光度值作为对照Aj空白，以DPPH溶液和无水乙醇混合测吸光度Ac。按式(1)计算各待测样品对DPPH 自由基的清除率［8］。

式中：Ai为2 mL样品溶液+2 mLDPPH试剂混合液的吸光度；Aj为2 mL样品溶液+2 mL空白溶剂(无水乙醇)混合液的吸光度；Ac为2 mLDPPH溶液+2 mL空白溶剂混合液的吸光度［9］。

2.3.2 超氧自由基O2-·清除能力的测定 采用邻苯三酚自氧化法。分别配制浓度为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL 的样品溶液，精密吸取l mL，分别加入4.5 mL，50 mmol/L的pH=8.2的Tris-HCl缓冲液，然后混匀，于25℃恒温水浴中保温20分钟后取出，立即加入25 mmol/L邻苯三酚溶液O.3 mL，快速摇匀后于25℃恒温水浴中反应5分钟，再加入8 mmol/L HCl l mL，混匀后终止反应，在325 nm测定吸光度，以蒸馏水代替样品作为空白对照。以Vc作阳性对照［10］。

每个样品均平行测定3次，取平均值。按式(2)计算清除率。

式中：A0为空白的平均吸光度；A1为样品溶液的平均吸光度。

2.3.3 清除羟自由基能力的测定 Fenton是产生·OH最常用的反应，原理如下：Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH。其原理是利用H2O2与Fe2+混合产生·OH，在体系中加入水杨酸捕捉·OH并产生有色物质，该物质在510 nm处有最大吸收。H2O2的量和Fe反应产生的·OH量成正比。将样品SHE、CHE、ZHE 配制成相当于含生药 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的样品溶液，样品组试管中分别加入 1 mL0.15 mmol/L FeSO40.4 mL 2 mmol/L水杨酸、0.2mL样品溶液、1mL6mmol/LH2O2和0.4mL蒸馏水；空白组用蒸馏水代替样品溶液，对照组用蒸馏水代替水杨酸，37℃反应30分钟。以Vc作阳性对照［11］。

每个样品均平行测定3次，取平均值。清除率计算公式(3)。

2.4 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行数据方差分析及计算IC50值。

3 结果

黑芝麻生品及炮制品和Vc在实验浓度范围内对DPPH自由基的清除能力呈现出良好的量效关系，清除率随浓度的增加而逐渐增强，当浓度达到一定程度时，清除率趋于平衡。黑芝麻生品、炒制品、蒸晒品及VC的 IC50分别为 0.405、0.194、0.088、0.009 mg/mL。经方差分析，黑芝麻生品组与炒制组比较，差异有统计学意义（P＜0.05)；黑芝麻生品组与蒸晒组比较，差异有统计学意义（P＜0.05)。炒制与九蒸九晒方法炮制后，黑芝麻DPPH清除能力增强。炒制组与蒸晒组比较，差异有统计学意义 （P＜0.05)。但从数据观测，3个样品中，蒸晒品清除DPPH自由基能力最强，九蒸九晒方法炮制的黑芝麻比炒制的方法DPPH清除能力更强。

黑芝麻生品及炮制品和Vc在实验浓度范围内对羟基自由基的清除能力呈现出良好的量效关系，清除率随浓度的增加而逐渐增强，黑芝麻生品、炒制品、蒸晒品及Vc的IC50分别为1.058、0.632、0.225、0.07 mg/mL。表明 3个样品中，蒸晒品的清除能力最强，炒制品其次，生品最弱。方差分析表明，黑芝麻生品组与炒制组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；黑芝麻生品组与蒸晒组比较，差异有统计学意义（P＜0.05)；炒制组与蒸晒组比较，差异有统计学意义（P＜0.05)。结果表明九蒸九晒的炮制方法能显著的增强黑芝麻羟基自由基的清除能力，而炒法炮制黑芝麻对其羟基自由基的清除能力的影响不太显著。图1—3、见表1。

图1 DPPH·的清除率比较

图2 超氧自由基清除能力比较

图3 羟基自由基的清除能力比较

表1 黑芝麻生品及不同炮制品的清除率

4 讨论

现代研究表明，黑芝麻具有多种药理作用，如对心脏及肾脏的保护作用、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤作用、抗炎、降压作用及促黑素生成，生发与乌发等作用［12］。而其多种药理作用都与其抗氧化作用有关。黑芝麻含有多种化学成分，主要包括：木脂素类，如芝麻素、芝麻林素、芝麻素酚、芝麻林素酚、芝麻酚、松脂醇等；脂类，如油酸、亚油酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、二十四烷酸、卵磷脂、甾醇等；维生素类，如维生素 E、烟酸、维生素 B1、B2、叶酸等；还有微量元素，如含钙、铁、锌、硒、铜、锰等；其他成分如黑芝麻色素、胡麻苷、蛋白质类、糖类等［13］。

黑芝麻的炮制方法现代多采用炒法。研究表明，芝麻炒后，化学成分的种类及含量与生品有一定的差异。高温焙炒后，芝麻素的含量明显下降，芝麻林素的含量也急剧降低，芝麻林素是芝麻油诸多抗氧化物中一种非常重要前体物质，在焙炒下可转化为芝麻素酚和芝麻酚，二者作为天然的有机酚类化合物，具有很强的抑菌和抗氧化活性。芝麻酚在生品当中不存在，炒后高温下经芝麻林素质子化水解转化而来，再经过形成水和阳离子及分子内构转化为芝麻素酚。炒后水溶性的木脂素芝麻素酚三糖苷受热不稳定，易发生分解，生成芝麻素酚［14］。焙炒芝麻油中的反式脂肪酸含量随温度的升高和时间的延长逐渐增多，随着焙炒时间的延长，丝氨酸、胱氨酸、赖氨酸和精氨酸的含量明显减少，而可溶性糖的含量随焙炒时间的延长呈逐渐降低的趋势［15］。这些化学成分的改变必然会对其药理作用产生影响。