葡萄糖—6—磷酸脱氢酶对镉胁迫下紫花苜蓿生长的调节作用

李彩弟 朱帅鹏 李萍 青海大学生态环境工程学院 青海西宁 8100166

前言

青藏高原地处亚欧大陆腹地，地势高耸，被称为世界“第三极”，其平均海拔在4000m以上，气候寒冷，年均温度在0℃左右，空气稀薄。青藏高原作为亚欧乃至世界水源涵养地和气候调节器，其科学研究和生态屏障价值不言而喻，并日益引起社会的重视。然而长期以来，过度放牧、草地退化现象的日益加剧以及片面追求工业发展严重破坏了青藏高原的生态环境，因此提高畜牧业发展水平成为了一项紧迫任务。

紫花苜蓿是一种深根性多年生优质豆科牧草，被誉为“牧草之王”，具有高蛋白质、耐酸碱、耐贫瘠等特点，对我国畜牧业的发展及遏制三化(沙化、退化、盐渍化)等均具有重大作用。青大1号紫花苜蓿是由青海大学自主培育的新品系，通过多年的选育，已经改变了在高寒地区不能安全越冬、返青率低的局面。

由于工业社会的的快速发展，如采矿、冶炼等，使水体、大气以及土壤中镉含量正在以每年数倍的速度增加。研究发现，镉会通过食物链进入人体，诱发各科疾病。Cd2+具有强植物毒性，引发诸如H2O2积累以及还原型谷胱甘肽发生瞬时损耗来抑制植物生长。研究发现，紫花苜蓿粗蛋白的含量很容易受土壤中Cd2+的含量影响。镉会破坏植物中的叶绿体结构，降低叶绿素含量，引起植物体衰老。有研究表明，镉胁迫能抑制盐芥幼苗生物量的积累，减少叶绿素和胡萝卜素的含量，降低叶片的光合放氧速率。并且研究发现，低浓度镉能促进这些植物的生长，高浓度镉处理会增大细胞膜的通透性，使细胞膜受损。

G6PDH作为磷酸戊糖途径中最重要的一个酶，严格调控着植物体内反应的速率及氧化还原反应的平衡。因此，G6PDH在植物体内有着不可替代的重要作用。陈超发现，G6PDH还具有抗氧化作用，能延长红豆杉细胞活力，提高紫杉醇产量。有国外的科学家发现，G6PDH是植物抗氧化过程中的一个抗性酶。植物G6PDH有2种形式，一种存在于细胞质中，被称为胞质型G6PDH，对氧化胁迫以及磷酸化无明显反应；另一种存在于细胞基质中，被称为基质型G6PDH，却在对氧化胁迫的响应中被检测到活性增强，这可能与G6PDH要行使不同调控功能有关。此外，在紫花苜宿受重金属铜胁迫，大豆受干旱胁迫时，也发现G6PDH的活性有不同程度的提高。现有的结果表明G6PDH参与了对环境胁迫的应答，探索G6PDH对环境胁迫的响应，将有利于我们进一步认识G6PDH的功能，丰富植物的防御反应机制。

本试验拟采用不同浓度CdCl2处理青大1号紫花苜蓿新品系幼苗，并测定其MDA及H2O2的含量和G6PDH活性等，初探G6PDH对镉胁迫下紫花苜蓿生长的影响。研究结果有助于进一步研究紫花苜蓿对镉胁迫的生理响应机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料：青大1号紫花苜蓿。

1.2 试验方法

1.2.1 实验材料准备

选取籽粒饱满、结构完整的大小均一的种子，先用自来水冲洗10min，再用10%NaClO4消毒20min，然后用去离子水反复冲洗，最后将种子放置于铺有滤纸的培养皿中。待种子晾干后，接种至锥形瓶中。每一个锥形瓶处理种子20粒，同时设置3个平行样，培养时间约为十天，其中萌发前约为三天，温度为18—20度，无需光照。萌发后约为七天，温度为24—26度，16小时光照与8小时黑暗交替进行。

1.2.2 叶绿素、丙二醛、过氧化氢含量的测定

(1)选取其中生理状态相同的植株移植于放有滤纸桥的新培养液中，培养液中CdCl2的浓度梯度为0，100μmol/L，200μmol/L，300μmol/L。其中每个浓度梯度为两瓶，每瓶为9棵植株。并继续在室温条件下培养至5cm左右。

(2)测量其株高，根长(包含侧根数目)，鲜重(包含根重与茎重)，叶绿素含量并记录数据。完成后样品保留备用。

(3)测量其MDA，H2O2含量，重复三次，并记录数据。

1.2.3 G6PDH含量的测定

(1)选取其中生理状态相同的植株移植于放有滤纸桥的新培养液中，培养液的体积均为50mL。并设置三个实验组与一个对照组，第一个实验组加入100μmol/L的CdCl2，第二个实验组加入2.5mM/L的Na3PO4，第三个实验组加入100μmol/L的CdCl2与2.5mM/L的Na3PO4。每瓶为9棵植株，并继续在室温条件下培养至5cm左右。

(2)测量其G6PDH含量，重复三次，并记录数据。

1.3 测定方法

1.3.1 紫花苜蓿叶片叶绿素的提取

(1)根据古川昭雄(1981)提出的无水乙醇法。取幼叶100～200mg，置于10mL离心管并加入5mL无水乙醇。

(2)置于黑暗处24h，取上清液4mL，测定其在665nm和649nm处的波长。

(3)并计算

式中OD665、OD649分别为相应波长下的光密度值，V为提取液的体积，W为叶片鲜重，结果即为叶绿素含量。

1.3.2 丙二醛含量的测定

(1)参照Hodges等(1999)方法，略有改动。取1g叶片加入3mL0.1%TCA并研磨匀浆，于3300rpm情况下离心20min，取上清液，完成后样品保留备用。

(2)取 上 清 液 500μL， 加 入 500μL0.1MTris—HCl，1mLTCA—TBA—HCl，置于离心管于95oC水浴30min,用冷水迅速冷却，于3300rpm情况下离心5min，测定OD600，OD532，OD440nm处的光吸收值，并计算MDA浓度(μmol/L)=6.45×(OD532—OD600)—0.56×OD440，结果即为丙二醛含量。

1.3.3 H2O2含量的测定

(1)根据patterson等(1984)采用的TCA提取法[19]。取1g叶片加入3mL0.1%TCA并研磨匀浆，于3300rpm min—1下离心20min，取上清液，完成后样品保留备用。

(2)取 上 清 液 500μL， 加 入 500μL0.1MTris—HCl，1mLKI，置于黑暗90min，测定OD390。

(3)并计算H2O2浓度(μmol/L)=OD390/M，结果即为H2O2含量。

1.3.4 蛋白质标准曲线的绘制

(1)根据考马斯亮蓝法。取6只试管，从1—6分别编号，按照表1加入标准蛋白液和蒸馏水，混合均匀。并向试管中加入5mL考马斯亮蓝G—250溶液，摇匀，放置2min后，在595nm波长下测定吸光度。

(2)根据测定的吸光度值绘制标准曲线(横坐标为蛋白质含量，纵坐标为吸光度)，并求出标准线性方程。

(3)取粗酶提取液1.0mL，放入试管中，并加入5mL考马斯亮蓝G—250溶液，摇匀，放置2min后，在595nm波长下测定吸光度值。根据吸光度值通过标准曲线查得蛋白质含量。

表1 考马斯亮蓝G—250标准蛋白溶液配制表Tab.1 Coomassie brilliant blue standard solution configuration

1.3.5 镉胁迫下紫花苜蓿叶片G6PDH活性的测定

(1)根据Setsuko Wakao(2005)采取的提取法，略有改动。取.0.5克叶片材料，用冰床研磨后，加入3mL配方[50mMHepes—Tris(pH7.8)，3mMMgCl2，1mMEDTA]研磨提取，匀浆液于4oC，12,000g离心20min，取上清即为粗酶提取液，并放置于冰床中。

(2)取 3mL配方加入 50μL15mMNADPNa2，50μL15mM6—PDHNa2，100μL粗酶提取液。空白对照用蒸馏水代替，启动反应，测量在340nm处10min的间隔为30s的吸光值。

(3)选取10min内吸光值变化比较均匀的数值作散点图，添加趋势线，得到其回归方程。

(4)并计算G6PDH酶活=a/(M×t)，其中a为线性方程斜率，M为蛋白质含量，t为反应时间10min。

1.4 数据处理

所得试验数据用Origin8.0，SPSS17.0数据处理软件进行。

2 结果与分析

2.1 鲜重、株高、根长在镉胁迫下的变化

表2 不同浓度CdCl2对幼苗的影响Tab.2 Effects of different concentrations of CdCl2 on Seedlings

注：各小写字母表示在0.05水平上有显著性差异

由表2可知：在CdCl2的胁迫浓度为100μmol L—1、200μmol L—1、300μmol L—1时，青大1号紫花苜蓿的鲜重、株高、根长随着CdCl2胁迫浓度的增加，呈现下降的趋势，其中鲜重分别下降了9.4%、26.5%、33.4%，株高分别下降7.7%、30.7%、40.3%，根长分别下降 9.3%、33.3%、40.7%，并且与对照组相比差异显著，说明一定浓度的CdCl2能使植株个体变矮，生长变缓，即对幼苗的生长产生了明显的抑制作用。并且在200μmol L—1以后大1号紫花苜蓿的鲜重、株高、根长的降低趋势明显变缓，说明紫花苜蓿对镉胁迫有一定的抵抗能力。

2.2 叶绿素含量在镉胁迫下的变化

由图1可知：在CdCl2的胁迫浓度为100μmol L—1、200μmol L—1、300μmol L—1时，紫花苜蓿幼苗中叶绿素含量随着镉浓度的的增加，出现下降的趋势。其中叶绿素a分别下降17.8%、25.7%、34.5%，叶绿素b分别下降15.4%、17.6%、33.0%， 总 叶 绿 素 含 量 分 别 下 降 14.0%、26.7%、50.6%这与在观察过程中出现的随着镉浓度的增加，植株变矮，叶片数量减少，叶片枯黄等症状相吻合。并且与对照组相比均差异显著。说明CdCl2对叶绿素的含量有明显的抑制作用。并且叶绿素b的含量的下降趋势相比于总叶绿素的含量的下降趋势要明显平缓。由此得出，CdCl2通过破坏叶绿素的结构，减少叶绿素的含量来抑制紫花苜蓿幼苗的光合作用。

图1 不同处理下紫花苜蓿幼苗叶绿素含量变化图Fig.1 Changes of chlorophyll content in Alfalfa seedlings under different stress

2.3 MDA含量在镉胁迫下的变化

图2 不同处理下紫花苜蓿幼苗MDA含量变化图Fig.2 Changes of MDA content in Alfalfa Seedlings unr ffrt t

据图2所示：随着CdCl2浓度的增加，紫花苜蓿幼苗中MDA含量升高，而且CdCl2胁迫浓度为 100μmol/L 时MDA含量为0.1958μmol/g，高于CdCl2胁迫浓度为0、200、300μmol/L时的 MDA含量为 0.1075、0.1582、0.1324μmol/g，与对照组相比均差异显著。因此可以得出，CdCl2胁迫浓度为100μmol/L时，对植物的伤害程度更大。当植物受到镉胁迫时，会产生大量的活性氧自由基引发膜脂过氧化，它的积累对于细胞膜及细胞结构会造成一定的伤害，所以丙二醛的含量可以反映植物在遭受胁迫时的伤害程度。

2.4 H2O2含量在镉胁迫下的变化

据图3所示：紫花苜蓿幼苗过氧化氢的含量随着CdCl2浓度呈现先升高后下降的趋势。其含量分别为0.051、0.077、0.065、0.064μmol/g。说明在逆境条件下，植物体内活性氧产生和清除系统受到破坏，所积累的活性氧能引发膜脂过氧化作用。过氧化氢是膜脂过氧化的产物，其含量反映植物遭受CdCl2伤害的程度。即在100μmol/L时紫花苜蓿幼苗体内遭受的破坏最严重，随着Cd2+质量浓度继续增加，幼苗体内会产生了某种防御机制从而减缓了遭受的破坏。

图3 不同处理下紫花苜蓿幼苗H2O2含量变化图Fig.3 Changes of H2O2 content in Alfalfa Seedlings under different stress

>2.5 G6PDH活性在镉胁迫和抑制剂交叉作用下下的变化

据图5所示：各柱形图的酶活性分别为0.0136U mg—1min—1，0.0183Umg—1min—1，0.0142Umg—1min—1 ，0.0112Umg—1min—1。即紫花苜蓿幼苗在CdCl2处理后G6PDH活性升高，说明紫花苜蓿幼苗体内对CdCl2造成的损伤产生了响应而导致G6PDH活性升高，而用抑制剂Na3PO4处理后G6PDH活性降低了22.4%，且差异显著，说明Na3PO4对G6PDH活性产生了抑制作用而导致活性降低，说明植物体内具有一定的防御机制，并且这种防御机制能在一定程度上减轻外部胁迫造成的损害。

图4 蛋白质定量标准曲线Fig.4 Protein standard curve

图5 不同处理下紫花苜蓿幼苗G6PDH活性变化图Fig.5 changes of G6PDH activity in Alfalfa Seedlings under different stress

3 讨论

3.1 镉胁迫下叶绿素的变化

叶绿素是光合作用中最重要的一类色素，包括叶绿素a、b、c、d、f以及原叶绿素和细菌叶绿素，对光能的传递、吸收、转换有重要作用。叶绿素很不稳定，在光、酸、碱、氧化剂等作用下会分解。在镉胁迫下，叶绿素膜受到破坏，叶绿素含量下降。在Cd2+在50—300μmol/L范围内，叶绿素含量急剧下降，导致叶片光合作用下降，生长变缓，植株变矮，叶片枯黄，这可能是Cd2+抑制紫花苜蓿幼苗生长的原因之一。

3.2 镉胁迫下MDA、H2O2的变化

植物在Cd2+胁迫下膜脂过氧化作用进程加快，植物体内的活性氧含量提高，活性氧的代谢平衡被打破，从而启动膜脂脱脂作用，破坏膜的结构和功能。重金属是脂质过氧化的诱变剂，会导致脂质过氧化产物MDA、H2O2含量增加。本实验表明，在Cd2+在0—100μmol/L范围内的条件下，MDA、H2O2含量急剧上升，而在100—300μmol/L范围内MDA、H2O2含量缓慢下降，表明在100μmol/L浓度时紫花苜蓿幼苗细胞内的功能结构收到的破坏最为严重，即体内收到的损害达到一定程度后才能启动防御机制。

3.3 镉胁迫下G6PDH的变化

在镉胁迫下，细胞膜的结构受到破坏，从而引起细胞膜通透性增加，而膜通透性变化越大，表示细胞受伤的程度越严重。紫花苜蓿幼苗正是通过提高G6PDH活性来抵抗Cd2+的胁迫。本实验中CdCl2处理后的植株G6PDH活性最高，双重处理后的植株G6PDH活性次之，而抑制剂Na3PO4处理后的G6PDH活性最低，表明一定浓度的Cd2+对G6PDH活性有促进作用，而抑制剂Na3PO4对G6PDH活性有明显的抑制作用。

4 结论

通过紫花苜蓿幼苗在抑制剂和镉胁迫下其MDA、H2O2、G6PDH活性的变化研究，结果表明：MDA、H2O2含量随着镉胁迫的浓度的增加出现升先降后升的变化规律，而且抑制剂Na3PO4对G6PDH活性具有明显的抑制作用。这表明紫花苜蓿幼苗具有一定的抗重金属胁迫性，能够在一定浓度的Cd2+条件下正常生长，并且紫花苜蓿幼苗具有一定的抗胁迫机制。并且说明G6PDH抑制剂会加剧苜蓿植株受到重金属胁迫后所造成的氧化伤害的程度，表明了苜蓿幼苗通过增加G6PDH的活性来抵抗重金属胁迫环境，避免植株受到严重的氧化伤害。因此G6PDH抑制剂会加剧植株遭受到重金属胁迫的氧化伤害程度，从而证实了G6PDH参与抗胁迫性的调节。