骨骼与性腺的交互作用及运动调控机制

徐帅 李世昌

摘 要：近年来骨骼作为独立的内分泌器官越来越受到研究者的认可，其分泌的骨钙素可作用于性腺，调节GPRC6A的分泌，从而影响睾酮的含量，最终改善男性生殖能力。GPRC6A又可反过来刺激骨骼的生长，促进骨健康；GPRC6A还参与骨钙素作用下的糖稳态，刺激胰腺中β细胞分泌胰岛素。运动干预能够增强骨内分泌功能，增加骨钙素分泌量，引起GPRC6A水平升高，睾酮水平上升。

关键词：骨钙素；性腺；生殖能力；GPRC6A；运动

中图分类号：G804.7 文献标识码：A 文章编号：1006-2076（2018）02-0081-06

Abstract：It has been widely recognized by researchers in recent years that bone is an independent endocrine organ. Bone secreted osteocalcin（OCN） can act on testis， then regulate GPRC6A secretion and progressively effect testosterone concentration， which consequently improves male fertility. In return， GPRC6A can stimulate bone development， improve bone health； GPRC6A also participate in glucose steady state under the action of OCN， stimulating the secretion of insulin of pancreatic β-cell. Exercise intervention can enhance bone endocrine function， increase the amount of OCN secretion， cause GPRC6A and testosterone levels rise.

Key words：osteocalcin； gonad； male fertility； GPRC6A； exercise

骨钙素（osteocalcin， OCN）作为骨骼中最丰富的蛋白质之一，最初仅被认为是骨矿化的抑制剂，最新研究发现，OCN具有更广泛的全身性作用：新陈代谢、繁殖能力和认知调节。由胰岛素调控的OCN在反馈环节中，可增加β细胞增殖以及胰岛素的分泌；提高神经递质的传递；会刺激男性睾丸的分泌活性，调节男性生殖功能，改善生育能力[1]。运动减肥、运动减脂的科学性已经得到证实，运动可直接提高骨质量，促进骨分泌活性，骨骼通过分泌OCN进一步刺激睾酮的合成，改善生殖能力。本研究主要通过骨分泌环节阐述生殖活性，为运动改善骨健康以及性发育功能提供新的思路。

1 对骨骼的新认识

骨骼一直被认为是静态结缔组织，起到支持和保护的作用，同时也是运动的必要条件。对脊椎动物研究发现，器官之间的相互依赖是潜在的生物学现象。最新研究表明，骨不仅是荷尔蒙输入受体，其本身也是一个内分泌器官。目前发现骨骼可分泌2种激素：一种是成纤维细胞生长因子23（fibroblast growth factor 23， FGF23），可通过控制磷酸盐稳态，调节矿物质代谢与骨健康；另外一种是OCN，可作用于胰岛素和性腺，调节葡萄糖稳态和雄性生殖功能。OCN是由成骨细胞和骨细胞特异性分泌的激素，由4个外显子和3个内含子组成，其分子量为6 kDa，占非胶原蛋白的10%～20%。OCN在体内主要以2种形态存在：羧化不全骨钙素（uncarboxylated osteocalcin， uOCN）和羧化完全骨钙素（carboxylated osteocalcin， cOCN）。其中uOCN与骨的结合能力低，包含0～2个γ-羧基谷氨酸残基，参与血液循化并激活多组织的生物功能；而cOCN无活性，主要存储在骨基质中。

骨骼的发生发展贯穿着整个生命历程，其中骨重建（bone remodeling）是一种双向过程：以破骨细胞介导的骨吸收；以成骨细胞介导的骨形成。甲状腺功能亢进患者具有高骨转换的状况，高转换引起的较高OCN，紧跟着较高的睾酮形成[2]。骨重建是由机械刺激、各类因子和激素共同作用的结果。性固醇类激素在青春期的骨骼发育阶段起着重要作用：雌激素对雌雄个体骨骼的发育、成熟和构塑、重建、维持骨量平衡具有重要的调节功能；雄激素对骨骼也具有调控作用[3]。值得关注的是，骨骼对雄激素的分泌也具有一定的调节作用，当OCN羧基化后，uOCN与G蛋白偶联受体GPRC6A结合，作用于Leydig细胞促进睾酮合成。最近还发现，OCN通过胰腺-性腺轴（pancreasbone-testis axis）发挥作用，独立于传统的下丘脑-垂体-性腺轴（hypothalamus-pituitary-testis axis， HPGA）并与其平行调节。[4-5]

2 睾酮的分泌

雄性激素是一类含19个碳原子的类固醇激素，其中睾酮的生物活性远远高于其他的代谢物，睾酮是由Leydig细胞分泌的一类雄激素，作为生育的必要调节物，可通过支持细胞活性、促进生殖细胞存活，调节雄性生殖系统[6]，由基础分泌方式和促性腺激素诱导分泌方式共同分泌。促性腺分泌受HPGA调节，通过刺激促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone， GnRH）的合成与分泌，引起黄体生成素（luteinizing hormone， LH）的释放，LH与Leydig细胞膜的受体结合，通过环磷酸腺苷（cyclic Adenosine monophosphate， cAMP）通路引起的磷酸化，使得胆固醇进入线粒体，最终引起睾酮的生成。除了传统的下丘脑传导通路，已经证明胰腺-骨-性腺轴（pancreas-bone-testis axis）是一种新型的调节男性生殖功能的结构[7-8]。机体通过胰腺分泌胰岛素并作用于成骨细胞，引起OCN合成，在pH 4.5的骨环境中引起骨吸收脱羧化，从而激活OCN形成有活性的OCN，uOCN可通过血液循环进入到睾丸组织中，与OCN的受体结合，同样引起cAMP通路的磷酸化，导致下游因子的进一步反应，从而提高睾酮合成，最终引起生殖细胞存活和精子发生能力提高，同时uOCN又可反作用于胰腺，引起β細胞增殖、分化和胰岛素的分泌，形成骨内分泌回路[9]，同时胰岛素再进一步作用于骨骼，从而提高OCN的合成。

3 骨骼与性腺

由成骨细胞分泌的激素OCN可进行一系列的调节，OCN经羧化后形成uOCN，促进β细胞增殖、胰岛素分泌以及肌肉、肝、白色脂肪细胞中胰岛素的敏感性。uOCN支持体内的糖稳态和能量代谢等功能[10]，uOCN又通过促进男性生殖能力提高睾丸中睾酮的分泌。向野生型小鼠体内注射OCN，可明显提高血睾酮的含量；而雄性OCN-/-小鼠由于睾酮含量的下降，会引起睾丸体积、附睾重量和精子发生显著下降；雌性OCN-/-小鼠却不会出现卵巢和性激素水平的异常[11-12]，说明OCN对雄性小鼠的生殖能力起到重要的调控作用。而性固醇类激素亦可提高骨含量并维持骨量。绝经女性由于卵巢雌激素分泌减少，骨质疏松症的发病率显著高于男性，男性的骨强度更高，骨折的风险较低。而若减少雄激素的分泌，或阉割雄性睾丸，均会引起骨量下降[13-14]。换言之，睾酮对骨骼具有反作用能力，两者是相互作用的关系。

3.1 骨内分泌对生殖能力的调控

对成骨细胞中缺乏胰岛素受体的小鼠（InsRosb-/-小鼠）进行正常饲养，出现葡萄糖不耐受和胰岛素不敏感的现象，这与OCN-/-小鼠表型相似。而在骨骼肌或脂肪组织中缺乏胰岛素受体并不会出现葡萄糖不耐受情况。InsRosb-/-小鼠具有较低的uOCN活性，也揭示了成骨细胞中胰岛素信号传递是OCN的决定因素。胰岛素可抑制成骨细胞中护骨素（osteoprotegerin， OPG）的表达，从而很好地阻碍破骨细胞分化。也就是说，胰岛素信号通过激活OCN达到自身的分泌，此外，小鼠与人的骨吸收障碍，也会导致OCN的羧基化减弱，导致葡萄糖不耐受[4]，最终还是引起睾酮合成受阻。

细胞生物学研究发现，成骨细胞通过体外培养Leydig细胞，可显著提高睾酮的分泌量。其特异性以3种方式得到证实：1）成骨细胞培养的上清液不能提高卵巢中性固醇类激素的生成；2）不能诱导Leydig细胞分泌雌二醇；3）无其他间质干细胞具有成骨细胞的此种功能[11]。且成骨细胞的此种功能在体内也得到了证实[15]。成骨细胞分泌的OCN可作用于2个靶细胞：β细胞和Leydig细胞。动物体内研究发现，成骨细胞对睾酮水平有重要作用，在DTAobs小鼠中，即一种成骨细胞缺失小鼠模型，消融成骨细胞后会影响成年老鼠的睾酮循环水平[15]。OCN缺陷小鼠可抑制LH水平[7]，同时观察LH对OCN的生成是否具有调节功能，在OCN-/-小鼠模型中，发现OCN和LH是2条平行的调控通路，OCN通过胰岛素信号和骨吸收刺激睾酮合成。进一步对原发性睾丸衰竭患者的研究发现，GPRC6A跨膜结构的错义发生，抑制了受体细胞膜局部化。现在提出的问题是：OCN的下游靶目标是LH，还是说存在“垂体介导”和“骨骼介导”两种独立的结构，其两者对男性生殖能力的调节是否都具有重要的作用？如果“骨骼介导”因素是重要的调控基质，那么OCN又是如何调节生殖功能的？OCN在小鼠中的表现又可否在人体中表达？体内外研究指出：1）在共培养条件下，未敲除成骨细胞OCN的野生型小鼠，引起睾丸中Leydig细胞增加，使得睾酮的生成；2）当uOCN含量升高时，引起Leydig细胞分泌提高；3）对野生型小鼠注射OCN可提高睾酮循环水平，可修复成骨细胞缺乏小鼠中由于OCN不足，引起睾酮分泌降低的状况[11]。在OCN不足小鼠中，其睾丸、附睾及精囊的重量均下降，而雄性Esp-/-小鼠出现相反现象。雄性OCN-/-小鼠精子数下降50%，而雄性Esp-/-小鼠却相应升高30%，Leydig细胞的成熟率由于OCN的缺失而受到阻碍，也说明了OCN有助于睾酮合成，睾酮水平在OCN-/-小鼠中低，而在Esp-/-小鼠中高，雌激素在OCN-/-小鼠和Esp-/-小鼠中维持在正常范围。Esp与OCN呈现相反的表达功能，Esp通过抑制OCN羧化抑制其活性。雄性OCNobs-/-小鼠与OCN-/-小鼠有相同的睾酮生成，而敲除Leydig细胞中OCN则不会影响雄性生殖能力。此外，Leydig细胞的成熟会因OCN的缺乏而停止，这些特征说明OCN对睾酮合成起重要作用。进一步的研究发现，通过提高血清OCN的羧化，会提高成骨细胞中胰岛素信号对葡萄糖和睾酮的调节[16]。

G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor， GPCR）存在于Leydig细胞中，GPCR家族中C家族6组A——GPRC6A作为OCN受体，也是目前唯一被确定的OCN受体[17]，是一种氨基酸感应G蛋白偶联受体，GPRC6A失活小鼠引起的代谢和生殖表型与OCN-/-小鼠相类似，而OCN和GPRC6A均缺乏的雄性小鼠，可引起雌二醇循环水平显著升高，导致睾酮/雌二醇比率下降。同时，GPRC6A-/-小鼠还可引起復杂的代谢异常，包括肥胖、葡萄糖不耐受、肝脂肪变性、胰岛素抵抗、高磷酸盐血症、骨质减少、肌肉衰减以及睾酮减少[18]。另外，GPRC6A-/-小鼠存在与下丘脑分泌LH调节睾酮相对立的表征，而不是单纯的抑制效果，也就是与HPGA相异常的生殖活性[19]。Oury[11]等对GPRC6A下游级联反应物的研究发现，uOCN与GPRC6A结合，GPRC6A通过cAMP-PK系统（环一磷酸腺苷-磷酸激酶系统）催化ATP转化为环磷酸腺苷cAMP，可引起cAMP含量升高并刺激其活性，使得cAMP与cAMP反应元素结合蛋白（cAMP response element binding protein， CREB）结合，引起CREB的磷酸化，CREB的激活会进一步提高睾酮生物合成的关键酶活性，使得胆固醇进入线粒体，最终引起睾酮含量的增加。其中的关键酶包括类固醇激素合成急性调控蛋白（steroidogenic acute regulatory protein， StAR）、Cyp11ɑ、3β-羟类固醇脱氢酶（3β-hydroxysteroid dehydrogenase， 3β-HSD）和Cyp17（一种细胞色素酶）。此外，人体间充质干细胞内cAMP/PKA/CREB通路的活化，还可引起骨形成[20]，形成共进共退的生理功能。

StAR帮助胆固醇从线粒体外膜转移到线粒体内膜，参与类固醇合成。StAR 的快速合成主要是通过cAMP第二信使系统作用于翻译和翻译后加工过程，cAMP会明显刺激StAR转录和mRNA的稳定性变化。进入线粒体内的胆固醇经线粒体内膜上的胆固醇侧链裂解酶（P450SCC）催化，27个碳原子的胆固醇经羟化、侧链裂解形成21个碳原子的孕烯醇酮，而在3β-HSD和Cyp17将孕烯醇酮转化为雄烯二酮，最终经Δ5途径生成睾酮[21]（图1）。

3.2 性腺对骨的调控

性固醇类激素在骨骼的生长发育中起着重要的作用。临床发现，性腺机能减退和血清睾酮下降是男性骨质疏松的重要因素。雄激素对成长期的男性骨骼起着重要作用，由于青春期时性腺机能减退引起性激素缺乏，最终导致骨量降低，而睾酮可提高骨骺闭合前的骨量。成年男性的血清游离睾酮含量与皮质骨大小成正相关[22]。睾酮可有效防止性腺机能减退的老年男性的骨量下降风险。GPRC6A在成骨细胞中也进行表达，GPRC6A-/-小鼠的会表现出矿化受损和成骨细胞功能下降。骨吸收引起的OCN释放，可通过骨骼中GPRC6A的活化作用，刺激成骨细胞调节骨形成和骨矿化[18]。并与OCN共同作用于胰岛素和β细胞，从而调节机体的葡萄糖水平和新陈代谢。

雄激素会直接影响于骨骼细胞，雄激素受体在成骨细胞、破骨细胞、骨细胞均可表达，雄激素对成骨细胞形成具有潜在的影响，并提高骨小梁的质量和完整性[14]。在男性青春期时，由睾丸通過GPRC6A来调控LH的分泌，还有骨骼释放的uOCN同样可以调控睾丸活性再调节GPRC6A分泌，从而引起骨骼的生长和内分泌功能的变化[23]。在细胞水平中，睾酮通过提高成骨细胞中OPG的合成，抑制破骨细胞活性；同时抑制成骨细胞分泌白细胞介素6（interleukin 6， IL-6），降低溶骨因子含量，减弱细胞凋亡从而增加成骨细胞寿命。此外，雄激素还刺激骨祖细胞增殖和成熟的成骨细胞分化。有研究表明，转化生长因子β（transforming growth factor β， TGFβ）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor， FGF）、胰岛素样生长因子II（insulinlike growth factor II， IGF-II）等可抑制骨吸收，促进骨组织发育，提高骨形成。雄激素通过提高TGFβ、FGF、IGF-II等因子的表达以改善成骨细胞增殖和分化功能[24]；最终引起骨结构的生长、维持和稳态（图1）。当pH降低时也会激活无活性TGFβ1，影响破骨细胞，抑制骨吸收，最终刺激成骨细胞前体细胞分化和增殖，提高骨量。

GPRC6A虽然也会在脑、心脏、肾脏等其他组织中表达，但其中的功能还需要进一步证实。更多的证据说明GPRC6A在炎症反应、能量代谢和内分泌系统中的作用，尤其是调控OCN介导的葡萄糖代谢水平[12]。其中OCN-GPRC6A循环体系可调节能量代谢和激素水平，OCN-/-GPRC6A-/-小鼠表现出糖耐量受损、胰岛素抵抗、肥胖、脂肪肝和较低睾酮水平，而OCN+/-GPRC6A+/-小鼠又会出现代谢异常的累加效应；条件性敲除GPRC6A，会引起OCN介导的胰岛素中β细胞和Leydig细胞中睾酮分泌量减少[25-26]。GPRC6A-/-小鼠与野生型小鼠相比，空腹胰岛素水平下降、空腹血糖水平升高，胰腺重量、胰腺数目、胰岛大小和胰岛素含量等明显下降；在进行胰岛素耐量实验中，GPRC6A-/-小鼠的胰岛素敏感性也出现显著下降[27]。Pi[28]等通过对HEK-293细胞中GPRC6A和OCN的表达量进行研究，发现OCN和GPRC6A结合后，可激活PLC-PKC/PKD1-ERK信号通路，该通路可刺激β细胞中胰岛素的分泌[29]，同时还促进胰腺中β细胞的增殖。同时也证实了GPRC6A通过与OCN、 氨基酸（精氨酸、鸟氨酸等）结合，促进胰腺刺激胰腺β细胞增殖，诱导GLUTag细胞GLP-1 的分泌，从而对机体的糖稳态进行调节[27]。

4 运动的调控作用

运动提高骨健康已经得到证实，而运动如何通过骨骼影响睾酮水平还没有统一的定论，尤其是针对运动对胰腺-骨-性腺轴的探索尚未有详细报道。

运动提高小鼠中OPG、FGF、IGF和TGF的分泌量，引起成骨细胞的增殖和分化；抑制IL-6、RANKL的分泌量，导致破骨细胞活性降低，最终改善骨骼的生长、发育和维持，引起骨内分泌OCN的活性升高。运动还可改善骨重建，进行8周的体育训练（抗阻、抗阻与有氧结合）均可提高骨形成能力；且短期训练也可提高骨形成标志物的升高[30]。有研究指出，短期体育锻炼即可影响骨转换，针对于骨代谢的变化，需要较长的时间适应物理负荷的变化[31]。Saydi[32]等人对47名青少年（12～17.9岁）身体活动进行调查，并用体力活动评分（A physical activity score， PAQsum）来量化身体活动（范围1～5），发现日常体力活动较高的青少年（PAQsum为2.4±0.8），其OCN的水平远高于较低活动量的青少年，而OCN和胰岛素敏感性之间没有统计学显著的相关性。对4周龄的雄性wistar大鼠进行8周的递增运动干预，跑台组和跳跃组的OCN含量显著高于控制组[33]。坚持有氧运动还可以提高精子质量[34]，同样的中等强度运动可减轻肥胖对精子生成的不利影响，增加睾酮分泌量[35]。对18～40岁的健康男性进行2个实验：30 min的间歇训练（90%～95%的峰值心率），再进行3小时的恢复和2小时的血糖-高胰岛素钳夹（胰岛素钳夹）实验，指出uOCN在胰岛素中的潜在作用，以及运动诱导胰岛素敏感性的新途径[36]。uOCN以GPRC6A介导的方式调节下游级联反应。而对GPRC6A受体敲除小鼠（GPRC6A receptor knockout， KO）和野生型小鼠进行跑轮实验，发现GPRC6A会影响小鼠自愿进行跑轮实验，KO小鼠跑轮效果远高于野生型小鼠，GPRC6A受体可参与调解运动的行为[37]，同时GPRC6A还可降低脂肪细胞中脂肪量和瘦素水平、增加肌肉质量和线粒体数目，并降低脂肪肝变性[18，38]（图2）。

綜上所述，运动改善骨健康，刺激OCN的分泌，从而调节GPRC6A的活性，提高睾酮含量；进一步，GPRC6A还可以改善脂肪组织、骨骼肌和肝的生理功能。GPRC6A还作为OCN在胰岛素的敏感性受体，从而介导骨骼—胰腺之间的关系，调控胰岛素的分泌。从运动的角度分析，运动作为复杂的物理刺激，不只是单一的线性作用，其中胰腺-骨-性腺轴也是相互交叉、相互影响的方式，这就需要从更广泛的角度去把握OCN-GPRC6A循环体系，从而为雄性生殖提供更精准的思路。

5 展望

本研究从骨内分泌角度对生殖功能进行探索，不仅说明运动对骨健康的改善，同时对骨内分泌促进睾酮合成提供了新的机制。研究发现OCN-GPRC6A循环体系还具有调节能量代谢和糖稳态作用，OCN作用于胰腺，影响胰岛素的分泌；GPRC6A也可作用于β细胞，引起β细胞的增殖和胰岛素的生成和分泌，共同调控血糖水平，这也为运动如何改善2型糖尿病提供了新的思路。大量研究发现GPRC6A与前列腺癌的发生存在联系，如何通过GPRC6A的作用机制来预防和缓解前列腺癌，同样需要进一步的探索。

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