黔南州茶园土壤中优势菌株变幻青霉分离及鉴定

周小露 ，周才富 ，刘丽明，罗学尹，李兴春，周才碧*

（1.湖南农业大学园艺园林学院，湖南长沙 410000；2.中共安龙县委机要局，贵州安龙 552400；3.黔南民族师范学院生物科学与农学院，贵州都匀 558000）

1 前言

贵州是种茶大省，其茶叶种植面积已高达700万亩；其中黔南州的种植面积为150万亩，占贵州省茶园总面积的21%，是重要茶区之一。黔南州明确提出有机茶的发展目标，在有机茶园的建设过程中，必须提高无害化有机肥的投入，构建茶园动态植保体系。然而大量使用化学肥料会带来土壤酸化、重金属超标、农药残留等问题。相关研究表明，贵州茶区如：都匀茶区[1，2]pH 值 3.00~4.00；湄潭和凤冈在 4.00~4.50；正安在 4.00~5.00，土壤大面积有酸化情况。不仅如此，茶树缺少大量元素，植株矮小，产量降低等问题也困扰着茶农。生物有机肥制作使用的是天然原料，比如秸秆、微生物、腐殖质等，在有效菌种发酵过程中产生的多种可溶性生理活性物质，如有机酸、维生素等能被植物迅速吸收，既达到改善土壤结构的目标，又可降低土壤的酸化程度[3-7]，加快土壤中氮、磷等元素循环[8-11]，减少Cd等[12]重金属的累积，有助于缓解土壤酸化趋势[13-14]，促进茶树提早萌发[16]。

目前，可用于茶树的生物有机肥较少，但使用化肥已经对茶园造成严重危害，研制出可供茶树使用的生物有机肥迫在眉睫，这就对生物技术专业的人员提出了新的市场研究方向。本实验以黔南州茶园优质土壤为材料，分离、纯化得到优势菌株，并通过形态鉴定和分子鉴定，旨在于明确优势菌株的背景，为其在茶园专用有机肥的开发提供参考。

2 材料与方法

2.1 试验材料

（1）土样：采集于省黔南州都匀市三江堰茶园。

（2）蔗糖：化学纯，天津市密欧化学试剂有限公司。

（3）琼脂粉：北京鼎国昌盛生物技术责任有限公司。

（4）硝酸钠：分析纯，北京化工厂。

（5）七水合硫酸镁：分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司。

（6）氯化钾：分析纯，天津市福晨化学试剂厂。

（7）七水合硫酸亚铁：分析纯，天津市致远化学试剂有限公司。

（8）磷酸二氢钾：分析纯，寿光市艾益农生物科技有限公司。

（9）其他材料：塑封袋，记号笔，铲子，药匙，蒸馏水，报纸，橡皮筋，保鲜膜，标签纸，马铃薯，利马豆粉，75%酒精。

2.2 试验仪器

（1）电子显微镜：XSP-8C，德卡精密量仪有限公司；

（2）电子天平：LTI000B，常熟市天量仪器有限责任公司；

（3）恒温培养箱：BHIC-250，上海博迅实业有限公司；

（4）超净工作台：SW-CYJ1FDA，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；

（5）高压蒸汽灭菌锅：GI5M4DS，致微仪器有限公司；

（6）冰箱：BCD-2651WBSV，上海帝览实业有限公司；

（7）其他仪器：培养皿，取样袋，酒精灯，滤纸，玻璃棒，烧杯，镊子，接种环，试管，三角瓶，量筒。

2.3 试验方法

2.3.1 培养基配备

参考周才碧[17]的方法，按试验要求进行适当修改，具体方法如下：

（1）PDA培养基：洋芋400 g，葡萄糖40 g，琼脂40 g，蒸馏水2000 mL。

（2）察氏培养基：蔗糖30 g，硝酸钠2 g，七水合硫酸镁0.5 g，氯化钾0.5 g，七水合硫酸亚铁0.01 g，磷酸二氢钾1.0 g，琼脂粉15 g，蒸馏水1000 mL。

2.3.2 菌株分离

（1）采集土壤：在贵州省都匀市三江堰茶园中，挑选优质土壤，用铲子挖出，装入密封袋中，用标签纸贴好并编号，带入实验室以便制作菌种悬液。

（2）材料消毒：防止带回土壤被周围环境中的菌种污染，实验操作要求在无菌条件下进行。提前2h把制备的培养基、实验所用的工具和蒸馏水（制备稀释浓度梯度的无菌水）放入高压灭菌锅中灭菌，以便使用。

（3）稀释菌悬液：取20g土壤放入三角瓶中，装入80mL的无菌水，摇晃 20min，制备菌种原悬液；再依次稀释得到 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6浓度梯度的菌种悬液。

（4）涂布接种：在酒精灯周围，用接种环蘸取两到三滴菌种悬浮液，使用涂布法在已经配好的培养基中接种，并且将接种浓度用标签纸在培养皿上做好记录。实验完成后，整理并关闭超净工作台，把已接种好的培养基放入25℃的培养箱中，培养6-7d。直到有菌落形成时，就可以对菌株进行纯化处理。

2.3.3 菌株纯化

（1）准备工作：培养至第6d，已经在培养基上可以明显观察到菌落。挑选培养基上生长旺盛的菌落，使用涂布平板划线法进行进一步的纯化处理。

（2）平板划线法纯化菌种：在超净工作台上进行划线操作：首先在培养皿的底部用记号笔画出五个区域，并标号。涂布划线时注意在酒精灯周围操作，先把接种环在酒精灯上灼烧2、3秒，等待接种环的温度降低，可以把接种环放入培养基中等待降温，防止较高的温度杀死菌种。接着用接种环沾取菌，从标记的第I个区域开始划线，画出3、4条线后，用一定的角度连接着第Ⅰ个区域，继续朝第Ⅱ个区域划出3-4条线，接着再朝第三个区域画线，以此类推。

2.3.4 菌株鉴定

在本试验中对于菌株的检测主要采用传统的生物形态学鉴定法和ITS序列鉴定法。

（1）形态学鉴定的方法：

利用电子显微镜对菌种进行观察并记录菌种的相关特征，初步判断该菌种的种类。被纯化的菌种检测出有25个孢子囊、分生孢子及厚垣孢子，根据记录的优势菌种形态特征，先对比、分析出一类属种。

生长速率的测定：在无菌环境下，把优势菌株打成直径为5 mm的菌饼，转移至条件为25℃的培养箱中，培养7 d后，量取优势菌的直径并再次记录优势菌的特征。

（2）分子鉴定的方法：

①DNA的提取

利用优势种的菌丝，分步进行操作：a.研磨菌丝，加进500 μL裂解液，放置10 min；b.加入浓度是3M的KAC 150 μ L，经离心（12000 rpm）15 min，取其上清；c.重复b，取上清液加入异丙醇，在12000 rpm条件下离心至15 min；d.取上清，加300 μL 70%的乙醇沉淀DNA，12000 rpm离心10 min，洗涤 4次；e.等水分散失，加 0.1×TE 30 μL，最终获取液体状态下的DNA。

②PCR扩增

引物是通用引物ITS4（5'-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC-3'，扩增体系的总体积是 25μL（DNA模板 1μL、10× buffer的缓冲液体 2.5μL、dNTPs 2μL、正引物1μL的体积、反向引物 1μL。Ex Taq DNA 聚合酶 0.125μL和ddH2O 17.4 μL），把体系中的不加菌株DNA提取物作为阴性对照，进行PCR扩增，扩增完成取出产物保存在4度冰箱，备用。

③电泳

a.制胶：称 0.2 g琼脂糖，加 20 mL的 0.5×TBE缓冲液（pH8.0），用微波炉加热1.5 min，拿出琼脂糖溶液，静置一段时间，加1 μL Goldview指示剂，摇匀；插好梳子，稳定模具，把凝胶倒入制胶模具。

b.电泳：将制胶板置于电泳槽中。取5 μL扩增产物加入2.5 μL溴酚蓝，混匀后点样。开启设备，设定电压（120 V）和时间（30 min）。

实验结束后在凝胶成像系统中查看拍照并将PCR扩增产物送到华大基因生物技术有限公司测序。

④序列分析

把测序所得序列放到National Center for Biotechnology Information（NCBI）核酸数据库Blast检测，然后下载相应菌株序列。把所有菌株序列导入MEGA6.0软件用多序列比对分析，构建系统发育树，肯定菌株种别。

2.4 数据分析

PCR产物测序后提交到GenBank中，经BLAST比对。

3 结果与分析

3.1 优势菌株的分离、纯化

以优质土壤为材料，利用稀释涂布分离得到5种菌；进一步利用平板划线纯化该菌株，最终得到优势菌株S3（详见图1），该菌株在25℃，PDA培养基中生长旺盛，生长周期较长。

3.2 目标菌株的鉴定

3.2.1 形态鉴定

利用传统形态学鉴定的方法，对3.1分离、纯化得到的菌株S3进行观察：利用电子显微镜观察，优势菌种S3边缘薄，中心有不规则状的条纹，向上突起的菌丝在球形顶囊上分生出粗糙的孢子梗，孢子梗中长出许多分生孢子，具有足细胞。呈橄榄色，放射圆柱状1-2节球状，菌落大小4-8.5nm。根据菌株S3的菌落和孢子形态等特征，初步推断该菌属为青霉属菌株（详见图 2）。

3.5.2 分子鉴定

提取菌株变幻青霉DNA，进行凝胶电泳及PCR扩增得到1条946 bp的清晰条带（图3），将此PCR产物测序后提交到GenBank中，经BLAST比对后发现，病原真菌的rDNA-ITS序列与Penicillium Variabile（HM469398）的序列相似度高达100%。依据比对结果构建系统进化树（图4），表明该菌应归为Penicillium Variabile。

结合形态学与分子生物学鉴定，确定从茶园土壤中分离纯化出的菌为变幻青霉。

图1 利用平板划线纯化出的优势菌S3

图2 S3形态特征

图3 S3 ITS扩增产物电泳图

图4 S3的系统发育树

4 结论与讨论

4.1 讨论

不同海拔、土壤、品种、树龄、季节及管理方式，茶园土壤的优势菌株各异，且随着土层的加深，真菌的种类和数量均逐渐减少；在茶园16目29属39种微生物中，霉菌的种类最多[18-19]。本实验取黔南州茶园优质土壤为材料，并对其进行稀释分离，将其样品悬液涂布于培养皿培养得出多种菌种，又对菌种进行分离，再挑取菌种纯化得到优势菌株S3。

为了明白优势菌株的背景，对于优势菌株S3的鉴定首要采取传统的生物形态学鉴定法，利用电子显微镜观察，初步推测该优势菌株S3为青霉属菌株。青霉属、曲霉属和蓝状菌属微生物均是土壤重要的腐生真菌，在不同地区和不同土壤类型都有广泛分布，特别是热带或亚热带的砖红壤、赤红壤、红壤、黄壤和燥红土等酸性土壤[20]。为了研究优势菌株的背景、便于进一步开发该菌株，需进一步明确目标菌的种属关系。经过ITS序列分析，优势菌株S3与Penicillium Variabile（HM469398）的序列相似度高达100%。依据比对结果构建系统进化树，结合形态鉴定表明该菌应归为变幻青霉Penicillium Variabile；该菌株在芦苇根际土壤、山西历山自然保护区土壤等[21-22]中均有发现，而在茶园土壤中为首次报道。

4.2 结论

本研究从优质土壤中稀释培养出菌种，并通过分离、纯化得到优势菌株S3；结合形态鉴定和分子鉴定可确定本次研究所得到的优势菌株S3为变幻青霉。

5 展望

目前，化学肥料的使用已经有不同的危害，微生物是土壤的重要组成部分，在土壤中有至关重要的作用；利用有益微生物参与有机肥的配制，可调节速效与缓效养分、提高肥料利用率，减轻氮肥造成的硝酸盐积累以及磷钾肥造成的重金属污染。但用变幻青霉作为生物有机肥的报道很少，对其是否有益于茶园土壤改善还有待于进一步研究。