MiR-384对HFFA诱导的Hepa1-6细胞sirt3/FOXO1信号通路的影响*

麦静愔，陈天阳，平 键，成 扬，陈建杰

本研究以高度游离的脂肪酸（HFFA）诱导Hepa1-6细胞，建立非酒精性脂肪性肝炎体外细胞模型，观察了MiR-384对细胞sirt3/FOXO1信号通路的影响，以探讨非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD） 发病机制与MiR-384之间的关系，为NAFLD的防治提供潜在的药物靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 小鼠肝癌细胞系Hepa1-6购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。细胞培养基DMEM、胎牛血清购自美国Thermo公司；油酸酯（OA）、棕榈酸酯（PA）购自美国Sigma公司；miR-384模拟物、抑制剂和阴性对照及si-sirt3均购自广州RiboBio公司；兔抗sirt3多克隆和抗FOXO1抗体购自美国Abcam公司；检测SOD和CAT试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 细胞模型制备及干预 取Hepa1-6细胞，以含10%胎牛血清的DMEM完全培养基培养。待细胞融合达80%时，换含有1%胎牛血清的DMEM培养基，加入OA和PA储存液，使两者终浓度分别为1 mmol/L和0.5 mmol/L，继续37℃培养24 h，建立非酒精性脂肪性肝炎体外细胞模型。测定肝细胞内活性氧水平，评估模型建立成功与否。随后，分别用miR-384 模 拟 物 、miR-ctrl、miR-384 抑 制 剂 、miR-384抑制剂 -ctrl、沉默信息调节因子 3（si-sirt3）或si-ctr l转染细胞48 h。收集细胞，进行后续实验。

1.3 肝细胞内活性氧（ROS）水平检测 以浓度为80 μmol/L 2，7-二氯荧光素二乙酸酯的荧光染料与Hepa1-6细胞37℃孵育30 min，随后上流式细胞仪（FCM）测定细胞内荧光强度。

1.4 细胞内蛋白表达检测 采用Western blot法，细胞经造模和分组干预后，吸弃培养液，预冷PBS漂洗，以RIPA裂解缓冲液抽提细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。取细胞蛋白30 μg，经8%SDS-PAGE凝胶电泳分离，并转移至PVDF膜。将膜在5%脱脂奶粉中封闭，并与抗sirt3或抗FOXO1（1：1000）孵育过夜。次日，在TTBS洗涤三次后，加入相应二抗（1：5000）1 h，室温孵育，加 ECL底物化学发光显色后曝光显影。应用图像分析软件分析目标条带，应用GAPDH或者β-actin(校正目标蛋白表达量。

1.5 细胞抗氧化酶活性检测 参照试剂盒说明书测定细胞内超氧化物歧化酶（SOD）和抗氧化蛋白过氧化氢酶（CAT）活性。

2 结果

2.1 各组Hepa1-6细胞ROS水平比较 与正常组（0.66±0.01）比，miR-384模拟物组和si-sirt3组细胞内 ROS水平显著升高 [分别为（37.3±1.13）和（10.4±0.36），P＜0.01]；与 HFFA 组（29.4±0.98）比，HFFA/miR-384抑制剂组细胞内 ROS水平显著降低[（12.8±0.41），P＜0.01，图 1]。

图1 各组Hepa1-6细胞ROS水平变化

2.2 各组Hepa1-6细胞sirt3蛋白表达情况 4组Hepa1-6细胞sirt3蛋白表达量不同，差异具有统计学意义（P＜0.01，图 2）；与正常（0.75±0.04）Hepa1-6细胞sirt3蛋白表达水平比，HFFA组细胞显著降低[（0.23±0.01），P＜0.01]；与 HFFA 组比，HFFA/sirt3组显著增加 [（0.83±0.03），P＜0.01]；与 HFFA/sirt3组比，HFFA/sirt3/miR-384组显著降低 [（0.46±0.02），P＜0.01]，提示 miR-384 可以抑制细胞 sirt3的表达。

图2 各组Hepa1-6细胞Sirt3蛋白表达比较

2.3 各组Hepa1-6细胞相关蛋白的表达情况 与对照组比，miR-384模拟物组Hepa1-6细胞sirt3蛋白和Forkhead转录因子O亚家族（FOXO）成员FOXO1 蛋白的表达显著减少[（0.3±0.01）对（0.2±0.01），P＜0.01]， 而 CAT 和锰 超 氧 化 物 歧 化 酶（MnSOD）表达显著增加 [（2.3±0.05）对（2.4±0.06），P＜0.01]；与 HFFA 组比，HFFA/miR-384 抑制剂组Hepa1-6细胞sirt3蛋白和FOXO1蛋白的表达显著增加[（0.5±0.02）对（0.7±0.01），P＜0.01]，MnSOD和CAT表达水平显著降低 [（2.0±0.03）对1.6±0.04），P＜0.01，图 3]。

图3 各组Hepa1-6细胞sirt3、FOXO1、MnSOD和CAT蛋白表达变化

2.4 脂肪变Hepa1-6细胞抗氧化酶SOD和CAT的活性检测情况 与NAFLD组SOD（327±3.45）和CAT（386±4.03）活性相比，正常组 SOD 和CAT[分别为（425±5.49）和（512±6.04），P＜0.01]和 miR-384 抑制剂组 SOD 和 CAT[分别为（406±4.79）和（447±5.38），P＜0.01]的活性显著升高（图 4）。

图4 miR-384抑制剂对脂肪变Hepa1-6细胞SOD和CAT活性的影响

3 讨论

Sirt3是sirtuins家族即NAD+依赖的第Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶的成员之一[1-5]，主要分布于线粒体中，能调节线粒体功能的许多方面，包括代谢、ATP生成、调节氧化应激反应等，处于线粒体功能调节的关键地位，是代谢功能和细胞生存的中枢调节因子，并且对抗衰老和癌症发生的作用较明显，可能与细胞内ROS水平有关[6-9]。相关研究表明Sirt3参与NAFLD的发病，上调Sirt3的表达可明显减轻NASH损伤，同时Sirt3过表达能够降低FOXO1乙酰化，同时提高CAT和MnSOD表达，进而抑制细胞内ROS的生成，来保护细胞免受氧化损伤[10-13]。

本研究为了评估mir-384与sirt3靶向功能的相关性，将小鼠sirt3编码序列插入到pTarget载体中，并用该pTarget-sirt3载体转染细胞，重新获得sirt表达。经流式细胞术检测评估用miR-384模拟物或阴性对照以及pTarget-sirt3或空载体共转染的Hepa1-6细胞ROS的产生，结果在miR-384模拟物存在下，sirt3的强制表达拯救了ROS水平。因此，sirt3是调节Hepa1-6细胞中氧化应激的miR-384下游的功能相关目标[14-16]。

为了进一步研究miR-384在HFFA诱导肝细胞脂肪毒性中的作用，我们分析了miR-384模拟或抑制剂转染后SOD和CAT的活性。与对照组比，用miR-384模拟单独或与HFFA转染Hepa1-6细胞都能诱导SOD和CAT活性的显着降低。相反，miR-384抑制剂显着逆转了HFFA诱导的脂毒性的促进作用。然而，通过siRNA抑制sirt3增强Hepa1-6细胞氧化损伤，并阻止miR-384抑制剂对HFFA诱导的细胞氧化损伤的抑制作用，表明miR-384在HFFA处理的细胞中靶标是sirt3。因此，在具有或不具有miR-384过表达的Hepa1-6细胞中检测了sirt3/FOXO1途径的关键组分的表达。由HFFA诱导的MiR-384上调和用miR-384模拟物处理也在Hepa1-6细胞中下调了FOXO1和Nuc FOXO1的表达，而用miR-384抑制剂处理可显着增加FOXO1和Nuc FOXO1水平。此外，由于MnSOD和CAT是sirt3/FOXO1途径的下游靶标，所以miR-384过表达可抑制sirt3/FOXO1途径，继而降低MnSOD和CAT水平。因此，miR-384过表达能加速细胞氧化损伤[17-19]。

综上所述，目前的研究结果表明miR-384的靶标是sirt3，从而导致HFFA诱导的氧化损伤加重，部分是通过抑制sirt3/FOXO1途径实现的。因此，miR-384可以作为NAFLD的潜在生物标志物和有效的治疗靶标，为以后的新药研发提供新的理论依据。