基于基因表达谱芯片杂交分析Lamprey-PHB2转染前后Chang liver细胞的基因表达差异

时 颖, 李 晴, 郭思呈, 李庆伟*, 李铁松*

(1.辽宁师范大学 生命科学学院 七鳃鳗研究中心,辽宁 大连 116081; 2.大连市第十二中学,辽宁 大连 116081)

七鳃鳗(Lampetrajaponica)隶属于圆口纲(Cyclostomata)七鳃鳗目(Petromyzonidae).广泛分布于寒、温带的淡水河近海水域,包括非寄生、淡水寄生及洄游寄生种类[1].七鳃鳗是已知最古老的现存于世的脊椎动物,在三十多亿年前就已出现,在系统进化过程中几乎没有形态上的变化,故有活化石之称.七鳃鳗作为联系无脊椎动物与脊椎动物之间的重要桥梁,反应了无脊椎动物的进化史.同时,作为脊椎动物最直接的祖先,七鳃鳗又是脊椎动物演化发育生物学研究的重要模式生物[2].

抗增殖蛋白2 (PHB2) 是PHB家族中的一员,是一种结构高度保守,分布广泛的膜蛋白,同时它也是一种多功能蛋白质,参与细胞的多种生命活动[3],最初作为与鼠B淋巴细胞的IgM受体相互作用的蛋白而被发现[4].人PHB2基因位于常染色体 12p13上,其全长 cDNA序列共有900个碱基对,编码中含299个氨基酸残基的PHB2蛋白,具有高度的保守性,其蛋白质结构中含有一个保守的PHB结构域[5].PHB 家族包括PHB1和PHB2两种亚型,人PHB1位于染色体17q21上,长11 kb.PHB1和PHB2蛋白以异源二聚体形式存在,12～16对异源二聚体聚合成直径约为20～25 nm的花环栅栏状的复合体,维持线粒体形态的稳定[6].

七鳃鳗(Lm)-PHB2与人PHB2氨基酸序列一致性较高,在PHB结构域处,两者的氨基酸序列极为相似,而在N-端和C-端,两者的氨基酸序列存在显著的差异.其3′端序列含有丰富的信息量,基因的3′非翻译区涉及了基因转录后水平的调控过程,主要参与调控mRNA的稳定性及降解速率、翻译时间和位点、控制翻译起始及效率[7-8].PHB2的C-端无规则卷曲部位具有ERα的作用位点[9],3′端非翻译区(3′UTR)是发挥抗增殖作用的部位[10].李铁松等[11]发现Lm-PHB2 的N-端具有信号肽,这可能是决定Lm-PHB2在细胞中定位迁移的因素.基因的5′UTR序列还参与转录调节,但其机制尚不明确.本文作者利用基因表达谱芯片技术分析Lm-PHB2的过表达对张氏肝(CHL)细胞中基因表达差异的影响,为PHB2作为药物靶点治疗人类疾病提供依据.

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

1.1.1 实验材料

CHL细胞、pEGFP-N1、pEGFP-N1-PHB2菌株由本实验室保存.

1.1.2 实验试剂

Trizol试剂购自GIBCO BRL;磷酸盐缓冲盐水(PBS)、胎牛血清、Hyclone1640培养基、胰酶购自大连晨钰有限公司;Translipid Transfection Reagent Kit购自北京TransGen Biotech公司.基因表达谱芯片由上海伯豪技术有限公司合成.实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)所用引物由上海生物工程技术有限公司合成,其序列如表1所示.

表1 实时荧光定量PCR所用引物的序列

1.2 实验方法

1.2.1 CHL细胞培养

CHL细胞自液氮中复苏,在37 ℃ 的CO2培养箱中进行培养,培养基选用含10%(质量分数)胎牛血清和1%(质量分数)双抗的1640培养基.每天更换1次培养基.当细胞密度达到90%时,用0.25%(体积分数)的胰酶进行消化传代,复苏后的CHL细胞经3次传代后用于实验研究.

1.2.2 瞬时转染

将CHL细胞接种于直径为6 cm的培养皿中,待CHL细胞融合度达到70%～80%时,按照Lipofectamine 2000脂质体瞬时转染试剂盒说明书转染.取pEGFP-N1和pEGFP-N1-Lm-PHB2质粒DNA 各8 μg分别溶于500 μL 1640培养基中,另取2个tube管分别加入500 μL 1640培养基和20 μL Lipofectamine 2000脂质体.待充分溶解后,将稀释后的脂质体与质粒DNA混合20 min,然后分别加入培养皿中,转染后放入37 ℃的 CO2培养箱中,培养4～6 h后更换培养基,继续培养24 h 后利用荧光显微镜观察转染效率.

1.2.3 RNA提取

图1 瞬时转染后CHL细胞.(a) pEGFP-N1,明场;(b) pEGFP-N1-Lm-PHB2明场;(c) pEGFP-N1 暗场;(d) pEGFP-N1-Lm-PHB2暗场

瞬时转染后的CHL细胞(图1)用PBS清洗1次,采用传统方法提取RNA,经0.5%琼脂糖凝胶电泳后,可清晰见到18S、28S及5S条带,无蛋白质和基因组污染.测得光密度(OD)值A260/A280均在1.8～2.0之间,说明提取的RNA符合实验要求,按说明书反转成cDNA进行后续实验.

1.2.4 实时荧光定量PCR(q-PCR)

使用TaKaRa的SYBR PrimeScript RT-PCR Kit 和AB Life Technologies 7500 PCR仪进行检测.以glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)作为内参,PCR反应体系和反应程序均按说明书.所有反应均重复3次,最终测出各基因的表达水平.

2 结果与分析

2.1 Lm-PHB2与其他物种氨基酸序列一致性的比较

从NCBI Protein数据库中选择了其他10个物种的PHB2与Lm-PHB2一起进行进化分析,各物种与东北七鳃鳗的序列一致性如表2所示.由表2可知,从低等的酿酒酵母到高等动物人的PHB2与Lm-PHB2之间都具有高度的序列一致性,这表明PHB2是一种高度保守的,在遗传进化中必不可少的蛋白.

表2 其他物种与Lm-PHB2的氨基酸序列一致性比较

2.2 Lm-PHB2与人PHB2的氨基酸序列排布

为了检测Lm-PHB2与人PHB2氨基酸序列的一致性,使用 Bioedit 7.0 软件对 Lm-PHB2和人PHB2氨基酸序列进行多重比对,结果如图2所示.由图2可知,二者序列一致性高达80%,且在PHB结构域二者的一致性极高,而N-端和C-端的序列一致性较低.这约20%的序列差异表明二者仍可能有许多功能上的差异,且这种差异是由N-端或C-端导致,因此利用基因表达谱芯片技术对Lm-PHB2转染后CHL细胞的基因表达差异进行分析.

图2 Lm-PHB2与人PHB2的氨基酸序列排布

2.3 RNA提取、基因表达谱芯片图像采集与数据分析

对基因芯片杂交阵列中提取出的杂交点的荧光信号强度进行定量分析和标准化处理.结果表明,按照差异倍数为3的标准,以转染pEGFP-N1质粒的CHL细胞为对照,在转染pEGFP-N1-Lm-PHB2质粒后的CHL细胞中共有270条基因表达差异显著,其中上调的基因有141条,下调的基因有129条.

基因本体(GO)在生物信息学领域中广泛使用.通过将差异基因做 GO 富集分析,可以把基因按照不同的功能进行归类,达到对基因进行注释和分类的目的.采取的统计学方法为Fisher精确检验,挑选的标准是落在某个term/pathway上的差异基因数目不小于4,p<0.05(显著差异).图3中,取得的 term/pathway按照enrich factor的值从大小降序排列,取前 30 个结果.Enrich factor 定义为:某个term中的差异基因数目与总的差异基因数目之比除以数据库term中总的基因数目与数据库中总的基因数目之比.由图3可知,与对照组相比,当CHL细胞转染pEGFP-N1-Lm-PHB2质粒后有大量的基因表达差异,这些基因涵盖了分子功能、细胞组分和生物学功能.在分子功能方面,电压-封闭的钾离子通道的活性和氧结合活性相关基因的表达受影响较为显著;在细胞组分方面,相关基因的表达受影响偏小,只有反式高尔基体膜和分泌颗粒膜相关基因受影响显著;在关键生物学过程中,相关基因的表达受影响最为显著,包括他汀类蛋白质的酪氨酸磷酸化、Stat3蛋白质的酪氨酸磷酸化、蛋白质酪氨酸磷酸化的正调控,肽酪氨酸磷酸化的正调控,其他有机体的细胞杀伤和细胞因子的产生与免疫反应都受到显著的影响.

KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)是系统分析基因功能、基因组信息的数据库,它有助于把基因及表达信息作为一个整体网络进行研究.KEGG提供了所有可能的代谢途径,包括碳水化合物、核苷、氨基酸等的代谢,及有机物的生物降解,其采用的分析方式与GO分析一样.KEGG结果显示,与对照组相比,当CHL细胞转染pEGFP-N1-Lm-PHB2质粒后有大量的信号通路受影响,其中5条信号通路中相关基因的变化极显著,分别是蛋白消化和吸收信号通路、嘌呤代谢信号通路、细胞因子间受体的相互作用、烟酸和烟酰胺代谢途径和嗅觉信号传导通路(图4).这表明Lm-PHB2在人正常细胞中发挥重要功能.

图3 GO富集分析

图4 KEGG富集分析

2.5 实时荧光定量PCR(q-PCR)验证

利用实时荧光定量PCR对转染pEGFP-N1和转染pEGFP-N1-Lm-PHB2质粒的CHL细胞中相关基因转录水平的变化进行检测(CHL细胞转染后如图5所示).结果表明,在氧化应激信号通路中过氧化氢酶(CAT)和人PHB2表达显著上调,而谷胱甘肽S转移酶(GST)表达显著下调,超氧化物歧化酶(SOD)的表达略微上调;在细胞周期信号通路中细胞周期蛋白25同源蛋白C(CDC25C)表达显著下调,细胞周期蛋白A2(Cyclin A2)的表达没有显著变化;在细胞凋亡信号通路中HAX1(haematopoietic cell specific protein 1-associated protein X-1)的表达量显著降低.这一结果与基因表达谱芯片的结果一致.

图5 转染pEGFP-N1质粒与pEGFP-N1-Lm-PHB2质粒后相关基因的表达差异.以转染pEGFP-N1质粒为对照组,*p<0.05,**p< 0.01

3 讨 论

对课题组前期从东北七鳃鳗中克隆出的PHB2(Lm-PHB2)与10个物种进行了同源序列比较,结果显示,PHB2在高等脊椎动物和低等动物中存在高度的保守性.Lm-PHB2与人PHB2基因序列一致性较高,这说明Lm-PHB2已经具备高等脊椎动物PHB2的基本结构特征,但二者氨基酸C-端和N-端序列的差异提示Lm-PHB2可能存在人PHB2所不具有的特殊功能,因此,后续通过基因表达谱芯片进行验证.

基因表达谱芯片结果显示,按照差异倍数大于3倍的标准,以转染pEGFP-N1质粒为对照,转染pEGFP-N1-Lm-PHB2后CHL细胞中共有270条显著差异表达基因;KEGG富集分析和GO富集分析结果显示,Lm-PHB2对CHL细胞的影响涵盖信号转导、转录调控、抗氧化活性等多种信号通路,这说明Lm-PHB2在CHL细胞中发挥着重要的作用并且作用极为广泛,有待于继续深入研究.

采用实时荧光定量PCR的方法对CHL细胞转染pEGFP-N1-Lm-PHB2后氧化应激、细胞周期和细胞凋亡信号通路中相关基因的转录水平进行检测.结果显示,在氧化应激信号通路中,CAT和内源性PHB2表达显著上调,GST表达显著下调,而SOD的表达有略微上调.SOD和CAT是生物体抗氧化酶系统中2种重要的酶类,可以及时清除活性氧自由基,保护细胞成分的结构和功能[12-13].当在CHL细胞中过表达Lm-PHB2时,CAT与SOD表达上调,二者共同参与抗氧化应激反应.GST具有消除体内过氧化物及解毒的双重功能,可催化谷胱甘肽GSH与中间代谢物的结合,成为水溶性化合物排出体外,起到解毒的作用[14].GST基因的表达下调说明Lm-PHB2在CHL细胞中的过表达对细胞无毒性.CDC25C是控制细胞周期进入M期的关键蛋白之一,通过激活Cyclin B1/CDC2促进细胞从G2期进入M期[15-16],其表达下调说明Lm-PHB2可能参与了细胞周期调控.HAX1是抗细胞凋亡蛋白,可以与细胞内多种凋亡相关蛋白如caspase 9,Parl和Omi/HtrA2 等相互作用[17],在调控凋亡信号通路中发挥作用,其表达量的显著下调说明Lm-PHB2可能参与细胞凋亡调控,并且Lm-PHB2的异常表达并没有促使CHL细胞凋亡.以上结果表明Lm-PHB2可能在抗氧化应激耐受性、细胞周期调控和抑制细胞凋亡中都发挥重要作用,但其中的机制还需要进一步研究.

4 结 论

选取了10个物种与本课题组前期克隆得到的东北七鳃鳗PHB2(Lm-PHB2)进行氨基酸序列相似性对比,结果表明各物种的PHB2氨基酸序列在PHB结构域处高度保守,但在N-端和C-端氨基酸序列保守性较低.利用基因表达谱芯片技术分析了将重组质粒pEGFP-N1-Lm-PHB2瞬时转染入CHL细胞后基因的表达差异,结果显示CHL细胞中共有270条显著差异表达基因,其中显著上调基因共141条,显著下调基因共129条,涉及细胞信号转导、细胞周期调节、细胞增殖、细胞代谢和细胞凋亡等多个方面.通过实时荧光定量PCR对基因表达谱芯片分析结果进行验证,结果显示转染pEGFP-N1-Lm-PHB2质粒后CDC25C、氧化应激相关基因(CAT、SOD、GST)和抗细胞凋亡基因(HAX1)均有显著性差异.