川芎提取物对电离辐照损伤实验小鼠脾脏组织细胞凋亡相关蛋白表达的影响

李 敏，赵 领，刘真宏，罗芳芳,，易辉燕,，赵德华，唐文诚，王继生,

(1. 西南医科大学药学院，四川 泸州 646000；2. 绵阳市第三人民医院·四川省精神卫生中心，四川 绵阳 621000)

川芎(LigusticumChuanxiong)为伞形科藁本属多年生草本植物，具有活血行气、祛风止痛等功效[1]。电离辐射致机体损伤主要产生自由基、活性氧类和促炎细胞因子/趋化因子，造成DNA、线粒体损伤或细胞凋亡，使基质干细胞的恢复及重新繁殖长期受到损害[2]。以往研究表明，川芎提取物能不同程度发挥对电离辐照损伤小鼠的保护作用。Ramalingam等[3]在细胞培养模型中研究发现，川芎提取物(LigusticumchuanxiongHort. extracts，LCXE)因其强大的供氢能力而具有较强的清除自由基抗氧化能力；Das等[4]研究表明，川芎的主要成分阿魏酸可通过下调硫代巴比妥酸反应产物(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)的形成，上调超氧化物歧化酶及过氧化氢酶活性，从而可预防辐照诱导的氧化应激；Jeong等[5]从川芎中提取出挥发油，经证实其具有抗氧化活性，能够抑制紫外线造成的DNA损伤，减少p21的表达，增加凋亡调节基因cyclineD1的表达，表明挥发油具有自由基清除能力，对UVB诱导的DNA损伤和细胞凋亡产生抑制作用。而川芎提取物对电离辐射损伤小鼠脾组织细胞凋亡保护机制，未见相关文献报道。

目前研究表明[6]，线粒体通透性转变是细胞凋亡发生的先导，Bcl-2家族控制着线粒体外膜和内膜的通透性[7]，其中Bcl-2主要分布于线粒体膜和细胞质中，具有拮抗凋亡的作用。Bax分布于细胞质中，具有促凋亡的作用。p53是核内的一种磷酸化蛋白质，是能够特异性与DNA序列结合的转录因子，当DNA损伤，可引起细胞内p53蛋白水平升高，阻断细胞增殖，诱导细胞凋亡。本研究针对电离辐射诱导线粒体通路细胞凋亡途径，研究川芎提取物在该细胞凋亡信号通路中是否具有保护作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 药物与试剂 川芎提取物，生药提取率为20 g·L-1，四川同泰植物化工有限公司。氨磷汀(批准文号：国药准字H20010403)，大连美罗大药厂。Bcl-2单克隆抗体、Bax单克隆抗体、p53单克隆抗体、DAB显色试剂盒、免疫组化染色试剂盒、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，均购自北京中杉生物技术有限公司；TUNEL细胞凋亡试剂盒，美国Roche公司；其他试剂均为国产分析纯

1.1.2 实验动物 昆明种♂小鼠120只，清洁级，体质量(20±2)g，由第三军医大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(军)2012-0011。饲养环境为昼夜比1 ∶1循环饲养，保持室内湿度 44%～65%，室温22～26 ℃，给予小鼠正常饮食饮水，适应性饲养1周。所有实验均经过绵阳市第三人民医院伦理委员会审核，均遵守实验动物照料和使用原则。

1.1.3 仪器 TB-718D型包埋机、TKY-TSI型自动组织脱水机、TK-218型恒温摊片烤片机(湖北泰维科技医疗有限公司)；BMJ-Ⅲ型病理组织包埋冷冻台(常州市中威电子仪器有限公司)；HM325型手动轮转切片机(Thermo公司)；AX10 imager A2/AX10 cam HRC正置荧光显微镜(Zeiss公司)。

1.2方法

1.2.1 动物分组及给药方法 设空白组(Normal)、辐照组(ionizing radiation，IR)、氨磷汀组(AMF，腹腔注射260 mg·kg-1)和川芎提取物用药组(LCXE1、LCXE2、LCXE3，分别灌胃给药50、100、200 mg·kg-1)。每组20只，辐照前，每天灌胃给药1次，每次0.5 mL，连续3 d，d 3给药后30 min即开始60Co γ射线辐照。

1.2.2 主要试剂溶液配制 10 g·L-1中性甲醛溶液：分别称取无水磷酸氢二钠0.65 g、Na2HPO4·2H2O 0.8 g于100 mL烧杯后，加ddH2O 85 mL搅拌至完全溶解，缓慢加入CH3OH 15 mL。

1.2.3 建立电离辐照损伤模型及组织的预处理 辐照条件：常规饲养7 d后，采用60Co γ射线全身一次性辐照。辐照条件[8]：5 Gy，辐照率为1.73 Gy·min-1；接受辐照小鼠组别：IR组(阳性对照组)、氨磷汀组、川芎提取物组(50、100、200 mg·kg-1)。小鼠接受辐照后，主要表现为饮水、进食相对减少，行动迟缓，嗜睡，皮毛光泽性稍差，呈微凌乱状态，偶会有腹泻，尤其明显的是，小鼠之间相互靠拢。分别于60Co γ辐照后第72、168 h时摘眼球取血于微量末梢采血管后，用3.5 g·L-1水合氯醛麻醉小鼠，经心脏灌注0.9 g·L-1生理盐水50 mL，取10 g·L-1中性甲醛50 mL经心脏灌流固定后，取脾脏组织，并置于10 g·L-1中性甲醛中固定30 min。每组10 只。将固定后的组织分装于对应标记的包埋盒，置于自动组织脱水机中进行脱水处理，包埋，3 μm连续切片。

1.2.4 免疫组化样品制备与观察 采用标准免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(streptavidin-perosidase，S-P)染色，加一抗p53(稀释度 1 ∶150)、Bax(稀释度 1 ∶200)、Bcl-2(稀释度 1 ∶100)，具体步骤按S-P法说明书操作，并采用DAB显色液显色，中性树脂封片。结果判定：p53阳性细胞为胞核呈黄色，Bax阳性细胞为胞质和(或)胞核呈黄色，Bcl-2阳性细胞为胞质和(或)核膜呈黄色。在每张切片随机选取10个400倍视野进行图像分析，各组选取部位一致。阳性细胞数越多，反映细胞内蛋白免疫活性(表达量)越高。

1.2.5 脾脏组织凋亡细胞的检测 按TUNEL检测试剂盒中检测石蜡切片组织凋亡的说明进行。采用正置荧光显微镜镜下观察，拍照留存，各组选取部位一致。利用Image-Pro Plus 6.0进行图像的分析处理，主要测量阳性表达细胞的平均光密度值。

2 结果

2.1川芎提取物对实验小鼠脾组织凋亡细胞数目的影响采用TUNEL法检测的凋亡细胞核染棕色，以圆形为主，散在三角形或弯月形染色，总体呈散在分布，正常细胞核染蓝色，实验以阳性细胞数目来衡量DNA受损程度。空白组仅见极少散在的凋亡细胞。与空白组比，IR、LCXE1、LCXE2、LCXE3、AMF组的小鼠脾组织凋亡细胞数量明显增加，差异具有显著性(P<0.05)，且IR组显著性最强(P<0.01)，说明辐照后小鼠脾脏组织细胞凋亡的发生较为明显。分别于小鼠接受60Co γ射线辐照后72、168 h观察发现，与IR组比较，LCXE1、LCXE2、AMF组小鼠脾组织TUNEL阳性细胞数量均明显减少(P<0.01)，且两观察点的LCXE1、LCXE2、LCXE3组小鼠脾组织TUNEL阳性细胞数量随用药剂量的增加而增加。除空白组外，随辐照后观察时间的推移，各组小鼠脾脏凋亡细胞数量均大幅度增加，见Tab 1、Fig 1。

Tab 1 TUNEL staining results of LCXEon apoptosis in splenic tissues of experimental mice n=10)

##P<0.01vsnormal group;*P<0.05,**P<0.01vsIR group

2.2川芎提取物对实验小鼠脾组织Bcl-2蛋白表达的影响Fig 2、Tab 2结果显示，正常组仅见极少散在的Bcl-2蛋白阳性染色。随辐照后观察时间的推移，各组小鼠脾脏组织Bcl-2蛋白表达量均有所增加。与IR组比，辐照后72 h，AMF、LCXE2、LCXE3组小鼠脾组织Bcl-2蛋白表达明显增加(P<0.01)；与IR组比，辐照后168 h，AMF、LCXE2、LCXE3组小鼠脾组织Bcl-2蛋白表达明显增加(P<0.01)。

2.3川芎提取物对实验小鼠脾组织Bax蛋白表达的影响在小鼠脾脏切片中，Bax阳性表达表现为胞质棕黄色深染。空白组未见Bax阳性表达，IR组在辐照后72 h时已观察到Bax的阳性表达，随辐照后时间的推移，Bax阳性表达增强，到168 h时表达明显高于72 h。与IR组比，辐照后72 h时，AMF、LCXE3组小鼠脾组织Bax蛋白表达量明显降低(P<0.01)，LCXE2组小鼠脾组织Bax蛋白表达量降低(P<0.05)；与IR组比，辐照后168 h时，AMF组小鼠脾组织Bax蛋白表达量明显降低(P<0.01)，LCXE2、LCXE3组降低(P<0.05)，见Tab 2、Fig 3。2.4川芎提取物对实验小鼠脾组织p53蛋白表达的影响在小鼠脾脏组织切片中，空白组见散在少量p53核染阳性表达。比较辐照后72 h和168 h时各组p53蛋白表达量，随辐照后时间的推移，p53蛋白表达增加，168 h时各组脾组织的p53表达明显高于72 h；与IR组比，AMF、LCXE2、LCXE3组小鼠脾组织p53蛋白表达量在辐照后72、168 h两个时间点均明显降低(P<0.01)，见Tab 2、Fig 4。

Fig 1 Effect of LCXE on the splenic tissue of ionizing radiated mice on the 72nd and 168th hour observed by TUNEL staining (×400)

Fig 2 Expression of Bcl-2 protein in the splenic tissue of ionizing radiated mice at the 72nd and 168th hour(×400)

Fig 3 Expression of Bax protein in the splenic tissue of ionizing radiated mice at the 72nd and 168th hour (×400)

Fig 4 Expression of p53 protein in the splenic tissue of ionizing radiated mice at the 72nd and 168th hour (×400)

GroupDose/mg·kg-1Bcl-2 (OD)72 h168 hBax (OD)72 h168 hp53 (OD)72 h168 hNormal-0.09±0.020.08±0.030.07±0.010.08±0.040.06±0.030.05±0.05IR-0.16±0.05##0.27±0.11##0.32±0.09##0.52±0.13##0.42±0.09##0.63±0.13##AMF2600.41±0.12∗∗0.51±0.17∗∗0.16±0.08∗∗0.31±0.12∗∗0.28±0.10∗∗0.45±0.17∗∗LCXE1500.24±0.080.34±0.13∗0.34±0.100.44±0.090.44±0.050.58±0.19LCXE21000.30±0.14∗∗0.48±0.19∗∗0.25±0.08∗0.45±0.15∗0.31±0.12∗∗0.42±0.14∗∗LCXE32000.33±0.08∗∗0.45±0.12∗∗0.24±0.10∗∗0.41±0.12∗0.30±0.11∗∗0.40±0.11∗∗

##P<0.01vsnormal;*P<0.05,**P<0.01vsIR

3 讨论

Lomax等[9]研究发现，电离辐照致机体损伤与DNA有关，当DNA损伤或营养缺乏等刺激时，易致MDM2基因抑制，其下游多条信号通路被激活，使得p53蛋白水平明显升高。而p53可上调Bax蛋白的表达，下调Bcl-2蛋白的表达，促进细胞凋亡[10]。本研究采用小鼠60Co γ辐照方法制备小鼠辐照损伤模型，免疫组化法观察川芎提取物对电离辐照损伤小鼠脾脏组织凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、p53表达的影响，TUNEL法观察细胞凋亡，以探讨川芎提取物对电离辐照损伤的保护机制。本研究结果显示，凋亡相关蛋白在正常小鼠脾脏组织中几乎没有表达，但在电离辐照损伤后，Bcl-2、p53、Bax蛋白则出现表达。抗凋亡蛋白Bcl-2的过度表达可以阻止p53诱导的细胞凋亡。在不同时间点观察发现，与IR组相比，AMF、LCXE2、LCXE3组小鼠脾组织Bcl-2蛋白表达量明显增加，而p53蛋白表达量均明显降低。说明川芎提取物可能通过上调Bcl-2蛋白，下调p53蛋白的表达，具有抗辐照损伤作用。不过值得注意的是，虽然p53诱导细胞凋亡途径中的Bcl-2蛋白表达增加，但细胞周期阻滞仍然发生，表明Bcl-2不直接阻断p53所有功能。因此，Bcl-2(或其他促生存Bcl-2家族成员)是在细胞凋亡信号中下游点，抑制p53诱导的凋亡[11]。在Bcl-2调节的细胞凋亡途径中，有两种蛋白受p53的转录调控：促凋亡效应分子Bax和Apaf-1(caspase-9激活的支架蛋白)[12]。本研究中，川芎提取物各剂量组辐照损伤小鼠的脾脏组织中Bax、p53蛋白表达均明显低于辐照组。表明川芎提取物可能通过下调Bax、p53蛋白的表达，从而对电离辐照损伤起到一定的保护作用。

本研究结果发现，川芎提取物对电离辐照损伤小鼠的脾脏组织具有一定的保护作用，其作用机制较为复杂，本文仅从线粒体凋亡通路阐述川芎提取物对电离辐射损伤的保护作用，这种保护作用机制仍需进一步的研究进行证实和补充。另外，川芎提取物在电离辐射损伤小鼠的其他细胞凋亡通路的调控仍需进一步研究。

(致谢：感谢中国工程物理研究院核物理与化学研究所的朱莎老师对动物造模提供帮助，感谢绵阳市第三人民医院病理科的宋大萍、江叶、袁华、郭敬萍、曾淋老师给予病理技术支持与指导，感谢王蕾、徐敬文、王小红、欧阳敏、曹莉莎、罗文、郭濠宁、吴思霖在动物实验中给予支持与帮助。)