外源EBR对芥菜下胚轴伸长的影响

朱磊　武向斌　李胜利　李严曼

摘 要： 油菜素内酯（BR）是一种植物激素，具有调控植物生长发育的作用。以芥菜为材料，采用外源2，4-表油菜素内酯（EBR）、乙烯利（Ethephon）、萘乙酸（NAA）等不同生长调节剂进行处理，初步研究了BR在芥菜下胚轴生长中的调控作用。研究发现，外源EBR处理在光照条件下可以促进芥菜下胚轴的伸长，而暗处理下却抑制下胚轴的生长；EBR与NAA协同促进下胚轴的伸长，EBR可以缓解Ethephon对下胚轴伸长的抑制作用，但EBR促进乙烯的合成。综上表明，光信号参与调控BR对下胚轴生长的调控作用，同时BR与乙烯、NAA等信号途径共同参与下胚轴的生长调控。

关键词： 芥菜；油菜素内酯；下胚轴；乙烯；萘乙酸

The effect of exogenous EBR on the hypocotyl elongation in leaf mustard

ZHU Lei，WU Xiangbin， LI Shengli， LI Yanman

（College of Horticulture， Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： Brassinolide （BR） is a kind of plant hormones that has a function in regulating plant growth and development. In this paper， exogenous 2， 4 -brassinolide （EBR）， Ethephon and naphthylacetic acid （NAA） were used to explore the effects of brassinolide on the hypocotyl elongation of mustard seedlings. It was found that EBR could promote the mustard hypocotyl elongation under light conditions， while it had an inhibition effect under dark conditions. EBR and NAA had a synergistic promoting effect on the hypocotyl elongation. EBR could alleviate the inhibition effect of Ethephon on the hypocotyl elongation of mustard seedlings， but it could promoted the synthesis of ethylene. The results indicated that the light signal was involved in the regulation of hypocotyls growth by BR， at the same time， BR， ethylene and NAA signaling pathways were all involved in the regulation of the hypocotyl growth.

Key words： Mustard； Brassinolide； Hypocotyl； Ethylene； Naphthylacetic acid

芥菜（Brassica juncea）的分布遍及我国各地，长江以南地区种植尤为广泛，在我国有2 000多年的栽培历史，是我国重要的鲜食和加工蔬菜[1]。芥菜是十字花科芸薹属一年生或二年生草本植物，起源于中国，种类繁多，具有丰富的遗传背景。

油菜素内酯又称芸薹素内酯，是继生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸、乙烯之后的第六大类植物激素。研究发现，油菜素内酯不仅在植物的生长发育过程中发挥重要的调控作用，还参与植物对逆境的抗性[2-5]。近年来关于油菜素内酯促进植物种子伸长及油菜素内酯与其他植物激素相互关系的报道也日见增多[6-9]。天然的油菜素内酯不仅可以促进柠条和紫穗槐种子发芽，同时对下胚轴切段伸长有明显促进作用[10]。豆类中的研究也发现，天然油菜素内酯处理后，黄豆、绿豆种子不仅发芽率提高，同时芽苗胚轴也明显伸长[11]。

研究发现，BR可以直接参与细胞发育过程，通过影响细胞的增殖和细胞分裂最终调控植物的生长发育[12]。BR与IAA信号途径互作实现对下胚轴的调控作用，BZR1蛋白可以直接结合在IAA19和ARF7的启动子区域，进而调控下胚轴的发育[13]。Bokyung Kim等[14]研究发现，BZR1蛋白的稳定性受光照的调控，进而调控下胚轴的伸长。以上的报道多集中于模式植物拟南芥中，芥菜是异源四倍体（AABB），同模式植物拟南芥相比具有更为复杂的表达模式和调控网络，因此笔者以芥菜为研究对象，通过不同浓度的外源油菜素内酯及其他激素的组合处理研究了芥菜幼苗的下胚轴伸长特性，为今后深入了解油菜素内酯对芥菜下胚轴伸长生长的精细调控机制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2015年3月至2016年9月进行，选用实验室保存的芥菜自交系种子9号，由河南农业大学园艺学院蔬菜系提供。

1.2 方法

1.2.1 不同处理对芥菜下胚轴伸长的影响 挑选籽粒饱满的种子用自来水冲洗，将消过毒的种子用镊子均匀放入铺有滤纸的广口瓶中，用移液枪向广口瓶中注入1 mL蒸馏水，每隔1 d注1次水，预培养3 d以促进种子的萌发。3 d后放入25 ℃组培室中培养，光处理条件下的光周期为16 h/8 h（白天/夜间），黑暗处理采用黑色布遮光。以蒸馏水处理作为对照（CK），分别采用0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1 mg·L-1 的2，4-表油菜素内酯（EBR，母液用无水乙醇配制）进行处理。为了研究不同激素处理对下胚轴伸长的影响，以蒸馏水处理作为对照（CK），2，4-表油菜素内酯（EBR，0.02 mg·L-1）、硝酸银（AgNO3，5 ?mol·L-1）、乙烯利（Ethephon，100 ?L·L-1）、萘乙酸（NAA，0.5 mg·L-1）、萘乙酸+表油菜素内酯（NAA 0.5 mg·L-1+EBR 0.02 mg·L-1）、乙烯利+表油菜素内酯（Ethephon 100 ?L·L-1+EBR 0.02 mg·L-1）、硝酸銀+乙烯利（AgNO3 5 ?mol·L-1+Ethephon 100 ?L·L-1）分别进行处理，7 d后开始测量下胚轴长度。每个试验重复3～5组，每组测定10～15株。

1.2.2 EBR處理对乙烯含量的影响 乙烯含量的测定参考Larsen and Cancel的方法，略有改动[15]。在芥菜种子出芽后10 d，分别采用0、0.1、1 mg·L-1的EBR处理幼苗24 h，每瓶选用生长势一致的幼苗10株，重复3～5瓶。将选出的幼苗放入密闭的塑料瓶（330 mL）中，3～5 h后抽取容器内气体1 mL，用GC-2010 plus气相色谱进行测定。色谱条件设定如下：GDX-502填充柱，FID检测器，氮气流速为20 mL·min-1，温度60 ℃。计算方法：乙烯生成量=c×V/m×t×1 000 （μL·kg-1·h-1），其中c代表样品测定值（μL·L-1），V代表容器体积（mL），t代表测定时间（h），m代表样品质量（kg）。

1.2.3 数据统计与分析 试验数据采用Excel 2010软件进行标准误差的计算和作图分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度的EBR处理对芥菜幼苗下胚轴伸长的影响

由图1可以看出，光处理下，不同浓度的EBR处理对芥菜幼苗下胚轴的伸长均有明显的促进作用，下胚轴长度随EBR浓度的升高呈现先上升后下降的变化趋势，从0.001～0.05 mg·L-1逐渐增大，0.05 mg·L-1之后却逐渐减小。其中0.05 mg·L-1的EBR处理对芥菜幼苗下胚轴伸长的影响最大，比对照增加了16.63%；暗处理中，与对照相比，EBR处理的芥菜幼苗下胚轴的伸长均受到抑制，下胚轴长度随EBR浓度的升高呈现先下降后上升再下降的变化趋势，0.2 mg·L-1的EBR处理的芥菜下胚轴最短。以上结果表明，光照在BR调控下胚轴的伸长过程中具有可逆反的作用，同时低浓度BR有明显的促进作用，而高浓度的BR则有一定的抑制效果。

2.2 不同外源激素处理对芥菜下胚轴伸长的影响

由图2可以看出，在光处理下，与对照相比较，Ethephon抑制了下胚轴的生长，而AgNO3部分抵消了Ethephon的抑制作用。EBR、NAA、EBR+NAA可以促进芥菜下胚轴的生长。在EBR+Ethephon和Ethephon+AgNO3组合处理中，乙烯均表现为抑制下胚轴的生长。

在暗处理中，对照处理的芥菜下胚轴最长，其次为EBR+NAA、EBR、AgNO3、NAA、EBR+Ethephon、Ethephon+AgNO3、Ethephon。同对照相比较，Ethephon、EBR和NAA均表现为抑制下胚轴生长，其中Ethephon的抑制作用较强，EBR和AgNO3均部分抵消了Ethephon的强烈抑制作用。

在所有的光处理和暗处理中，黑暗处理时下胚轴长度均高于光照处理的；EBR和NAA可协同促进下胚轴的伸长；在调控芥菜下胚轴的生长作用上，Ethephon具有明显的抑制作用，而EBR具有明显的促进作用，且EBR可以抵消Ethephon的抑制作用。

2.3 EBR处理后乙烯含量的变化

如图3所示，当用0.1 mg·L-1的EBR处理芥菜时，乙烯含量比对照显著增加，当用1 mg·L-1的EBR处理芥菜时，乙烯生成量比0.1 mg·L-1的EBR处理时显著增加，这表明EBR可以促进芥菜幼苗乙烯的合成。但是乙烯生成量的上升与下胚轴的伸长并不成正相关，因此乙烯生成量并不是下胚轴伸长的关键因素。

3 讨论与结论

油菜素内酯具有广泛的生长发育调节功能，参与多种植物的生命活动过程。笔者研究发现，外源油菜素内酯在光照条件下可以促进芥菜下胚轴的伸长，但是浓度高于0.05 mg·L-1却表现为抑制作用，这表明低浓度油菜素内酯具有促进作用而高浓度却有一定的抑制作用。黑暗条件下，外源油菜素内酯抑制下胚轴的伸长，随着处理浓度的升高，抑制效果略微下降，这表明可能存在高浓度促进的效果，本次试验中采用的最高浓度为1 mg·L-1，更高浓度的效果有待于进一步研究。从本试验结果分析，外源EBR施用浓度对于下胚轴的抑制或促进作用存在差异，同时与光照密切相关，这表明光照可能参与了芥菜下胚轴的生长调控作用。前人研究结果表明，植物幼苗的生长发育调控机制在有无光照条件下差别比较大，尤其是下胚轴的伸长、子叶节的弯曲、子叶和胚轴的着色等都与光信号密切相关[14，16]。

乙烯在黑暗条件下可以诱导产生“三重反应”，具有明显的促使下胚轴变短的作用。本研究中，乙烯利处理无论在黑暗或光照条件下均表现为抑制下胚轴伸长，同时AgNO3可以抵消乙烯利的抑制作用。此外，EBR+Ethephon处理抵消了Ethephon处理中下胚轴被抑制的长度，这表明外源EBR和AgNO3可能具有相似的作用。 BR可以提高芥菜中乙烯的合成，这与前人的研究结果相似。例如王建华等[17]研究发现，BR促进叶片和叶柄乙烯的产生。油菜素甾醇类可以促进ACS5蛋白的稳定性，从而调控乙烯的生物合成[18]。但是EBR与Ethephon对芥菜下胚轴生长的作用却截然相反，这表明乙烯和BR在调控芥菜下胚轴伸长的生理现象上存在着拮抗作用，同时乙烯的含量与下胚轴的伸长关系并不大。Liesbeth De Grauwe等[19]的研究指出，ETH信号途径通过PIN调控生长素的转运和分布，进而影响下胚轴的生长发育，而BR抑制PIN途径。此外，BR可以通过FERONIA调控途径拮抗乙烯诱导的下胚轴缩短作用[20]。结合本试验的结果，芥菜下胚轴的伸长可能受到多种内源激素信号途径的共同调控。本研究结果表明，芥菜下胚轴的伸长与光照和BR的浓度密切相关，同时它们可能与乙烯、生长素等信号途径互作共同调控下胚轴的伸长。

参考文献

[1] 沈进娟，冉广葵，张绍荣，等.航天诱变对芥菜生理生化特性的影响[J].西南农业学报，2012，25（4）：1242-1247.

[2] KHAN M，ROZHON W，BIGEARD J，et al.Brassinosteroid regulated GSK 3/Shaggy-like kinases phosphorylate mitogen-activated protein（MAP） kinase kinases，which control stomata development in Arabidopsis thaliana[J].Journal of Biological Chemistry，2013，288（11）：7519-7527.

[3] HARTWIG T，CHUCK GS，FUJIOKA S，et al.Brassinosteroid contro1 of sex determination in maize[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2011，108（49）：19814-19819.

[4] 李雅洁，张其安，陆晓民.油菜素内酯对硝酸钙胁迫下黄瓜幼苗抗氧化系统及可溶性蛋白表达的影响[J].安徽科技学院学报，2017，31（1）：35-40.

[5] 王舒甜，张金池，张亮.油菜素内酯对盐胁迫下香樟叶片光合色素以及叶绿素荧光的影响[J].浙江大学学报（农业与生命科学版），2017，43（1）：45-53.

[6] 程彥伟，丁贺，韩建明，等.天然油菜素内酯对豆类种子发芽和胚根下胚轴伸长的影响[J].江苏农业科学，2014，42（9）：140-142.

[7] 刘灵，李海航，杨丽霞，等.油菜素内酯促进绿豆下胚轴不定根发生研究[J].科技导报，2007，5（25）：227.

[8] 徐如涓，郭一松，刘毓橘.表油菜素内酯对黄瓜下胚轴伸长，内源GA3，ABA及淀粉含量的影响[J].植物生理学报，1990，16（2）：125-130.

[9] 李元元，曹清河.油菜素内酯参与调控植物生长发育与抗逆性的机制及其育种应用研究[J].中国农业科技导报，2015，17（2）：25-32.

[10] 李凯荣，韩刚.天然油菜素内酯促进柠条和紫穗槐种子发芽及下胚轴伸长效应[J].西北林学院学报，2003，18（4）：17-20.

[11] 程彦伟，丁贺，韩建明，等.天然油菜素内酯对豆类种子发芽和胚根下胚轴伸长的影响[J].江苏农业科学，2014，42（9）：140-142.

[12] GUDESBLAT G E，RUSSINOVA E.Plants grow on brassinosteroids[J].Current Opinion in Plant Biology，2011，14（5）：530.

[13] ZHOU X Y，SONG L，XUE H W.Brassinosteroids regulate the differential growth of arabidopsis hypocotyls through auxin signaling components IAA19 and ARF7[J].Molecular Plant，2013，6（3）：887-904.

[14] KIM B，JEONG Y J，CORVALAN C，et al.Darkness and gulliver2/phyB mutation decrease the abundance of phosphorylated BZR1 to activate brassinosteroid signaling in Arabidopsis[J].The Plant Journal，2014，77（5）：737-747.

[15] LARSEN P B，CANCEL J D.Enhanced ethylene responsiveness in the Arabidopsis eer1 mutant results from a loss-of-function mutation in the protein phosphatase 2AA regulatory subunit，RCN1[J].The Plant Journal，2003，34（5）：709-718.

[16] MCNELLIS T W，DENG XW.Light control of seedling morphogenetic pattern[J].Plant Cell，1995，7（11）：1749-1761.

[17] 王建华，徐同.油菜素内酯对酸雨伤害的棉花子叶膜脂质过氧化和乙烯产生的影响[J].湖北农学院学报，1991，11（4）：1-6.

[18] HANSEN M，CHAE HS，KIEBER J J.Regulation of ACS protein stability by cytokinin and brassinosteroid[J].Plant Journal for Cell & Molecular Biology，2009，57（4）：606-614.

[19] GRAUWE L D E ，VANDENBUSSCHE F，TIETZ O，et al.Auxin，ethylene and brassinosteroids：tripartite control of growth in the Arabidopsis thaliana hypocotyl[J].Plant & Cell Physiology，2005，46（6）：827-836.

[20] DESLAURIERS S D，LARSEN P B.FERONIA Is a key modulator of brassinosteroid and ethylene responsiveness in Arabidopsis hypocotyls[J]. Molecular Plant，2010，3（3）：626-640.