Ki-67、p53、P504s在胃癌前病变和早期胃癌中的表达及其意义

余艳秋 王建宁 翟启智 孙 琦 沈珊珊 邹晓平*

南京医科大学附属江宁医院消化科1(211100)南京大学医学院附属鼓楼医院病理科2 消化科3

背景：胃癌的发生是多因素、多步骤、逐渐进展的过程，发生细胞学和结构异常的同时常存在某些分子表达的异常，涉及多种癌基因的活化和抑癌基因的失活。目的：探讨Ki-67、p53、P504s在正常胃黏膜、萎缩性胃炎伴肠化生、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变和早期胃癌中的表达及其意义。方法：收集2015年1月—2016年12月南京大学医学院附属鼓楼医院44例正常胃黏膜、44例萎缩性胃炎伴肠化生黏膜、41例低级别上皮内瘤变、38例高级别上皮内瘤变和35例早期胃癌组织，以免疫组化法检测Ki-67、p53、P504s表达。结果：Ki-67、p53、P504s在萎缩性胃炎伴肠化生、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变、早期胃癌中的表达阳性率逐渐上升，且均显著高于正常胃黏膜组织(P<0.05)。结论：Ki-67、p53、P504s表达与胃癌的发生、发展密切相关，参与了胃癌发生的早期过程，检测上述三种分子标记物有助于判断病变的严重程度和进展趋势，有利于提高胃癌前病变和早期胃癌的检出率。

胃癌的发生是一个漫长的过程，根据Correa学说[1]，肠型胃癌的发生是一个由正常黏膜-慢性炎症-萎缩-肠化生-异型增生-癌变的逐渐进展的多因素、多步骤过程。世界卫生组织(WHO)为统一病理诊断标准，提出了“上皮内瘤变”的概念，将其定义为一种具有恶性潜能的非浸润性病变，可适用于所有浸润性癌的前驱病变，具有潜在的分子学异常[2]。p53(突变型)和Ki-67(核蛋白抗体)表达与消化道肿瘤的发生、发展、分化程度、浸润深度、转移、预后等环节密切相关。P504s又称α-甲基酰酶辅酶A消旋酶(AMACR)，在支链脂肪酸和脂肪酸衍生物的β氧化以及胆酸代谢中间产物的氧化中发挥重要作用。P504s在肾癌、前列腺癌、结肠癌中高表达[3-5]，有研究[6]发现P504s在胃癌中的表达高于正常胃黏膜及其癌前病变组织，认为其参与了胃癌的发生、发展过程。本研究通过应用免疫组化染色检测正常胃黏膜、癌前病变、早期胃癌中Ki-67、p53、P504s的表达，旨在探讨三者在胃癌发生、发展过程中的意义。

材料与方法

一、资料来源

收集2015年1月—2016年12月在南京大学医学院附属鼓楼医院接受内镜下切除术的胃组织114例，其中男75例，女39例，平均年龄(61.6±4.4)岁；术后病理诊断为早期胃癌35例，低级别上皮内瘤变41例，高级别上皮内瘤变38例。选取同期胃镜活检病理为萎缩性胃炎伴肠化生44例，并取41例低级别上皮内瘤变和3例高级别上皮内瘤变旁正常胃黏膜组织作为对照组。

二、研究方法

所有标本经4%甲醛溶液固定，常规脱水、石蜡包埋，厚2 μm连续切片。单克隆抗体Ki-67、P504s购自丹麦DAKO公司，突变型p53购自北京中杉金桥生物技术有限公司。Ki-67、P504s、p53工作浓度分别为1∶300、1∶200、1∶200。免疫组化染色采用Envision二步法，具体步骤按说明书进行操作。以PBS代替一抗作为阴性对照，阳性对照为已知的阳性组织切片。

结果判断：Ki-67和p53阳性表达定位于细胞核，P504s阳性表达定位于细胞质，呈弥漫性颗粒状阳性。计数Ki-67阳性细胞数，随机选取5个高倍视野，计算每100个细胞中的阳性细胞数，取均值，阳性细胞数<10%为阴性(-)，10%～25%为弱阳性(+)，25%～75%为中等阳性(++)，>75%为强阳性(+++)。以染色强度和阳性细胞数评估p53、P504s表达。染色强度：0分，细胞不着色(-)；1分，淡黄色(+)；2分，棕黄色(++)；3分，棕褐色(+++)。选取5个高倍镜视野，计数阳性细胞数，取均值。1分，0～25%；2分，25%～50%；3分，50%～75%；4分，75%～100%。染色强度评分与阳性细胞数评分之积作为染色评分，0～1分为阴性(-)，2～4分为弱阳性(+)，5～8分为中等阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。

三、统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件，计数资料的比较采用χ2检验或Fisher精确检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、Ki-67在不同阶段胃黏膜中的表达

44例正常胃黏膜中Ki-67阳性表达仅9例，均为弱阳性。与正常胃黏膜组相比，萎缩性胃炎伴肠化生、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变、早期胃癌组Ki-67表达阳性率显著升高(P<0.05)。除早期胃癌组Ki-67表达阳性率与高级别上皮内瘤变组无明显差异外(P>0.05)，随着病变程度的加重，Ki-67表达阳性率逐渐升高(P<0.05)。而早期胃癌组Ki-67强阳性率显著高于高级别上皮内瘤变组(P=0.011)(图1、表1)。

二、p53在不同阶段胃黏膜中的表达

44例正常胃黏膜中无p53阳性表达，随着病变程度的加重，p53表达逐渐增加。与正常胃黏膜组相比，萎缩性胃炎伴肠化生组p53表达阳性率无明显差异，低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变、早期胃癌组显著增加(P<0.05)。从萎缩性胃炎伴肠化生-低级别上皮内瘤变-高级别上皮内瘤变，p53表达阳性率逐渐升高，组间相比差异有统计学意义(P<0.05)。早期胃癌组p53表达阳性率、强阳性率与高级别上皮内瘤变组相比均无明显差异(P>0.05)(图2、表2)。

三、P504s在不同阶段胃黏膜中的表达

A：正常胃黏膜组织；B：萎缩性胃炎伴肠化生组织；C：低级别上皮内瘤变组织；D：高级别上皮内瘤变组织；E：早期胃癌组织

A：正常胃黏膜组织；B：萎缩性胃炎伴肠化生组织；C：低级别上皮内瘤变组织；D：高级别上皮内瘤变组织；E：早期胃癌组织

A：正常胃黏膜组织；B：萎缩性胃炎伴肠化生组织；C：低级别上皮内瘤变组织；D：高级别上皮内瘤变组织；E：早期胃癌组织

44例正常胃黏膜中P504s阳性表达7例，阳性表达率为15.9%。与正常胃黏膜组相比，萎缩性胃炎伴肠化生、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变、早期胃癌组P504s表达阳性率均显著增加(P<0.05)。除高级别上皮内瘤变组与低级别上皮内瘤变组P504s表达阳性率差异有统计学意义(P<0.05)，随着病变程度的加重，P504s表达阳性率无明显差异(P>0.05)。早期胃癌组P504s表达强阳性率与高级别上皮内瘤变组相比无明显差异(P=0.103)(图3、表3)。

讨 论

胃黏膜癌变是一个复杂的过程，常需经历多年的癌前病变阶段。2010年《消化系统肿瘤WHO分类》提出，在肿瘤转化过程中细胞增殖和分化异常可出现在形态学异常变化前，强调上皮内瘤变通常是基于恶性转化分子改变的细胞学和结构异常，强调其肿瘤的性质，而非绝对是肿瘤的形态[2]。在此基础上，本研究按胃癌Correa级联反应过程收集了内镜活检或内镜切除术后不同阶段的胃黏膜组织，观察在肿瘤发生、发展过程中，发生细胞学和结构异常的同时是否存在某些分子表达异常。

在胃癌发生、发展的过程中，常涉及多种癌基因的活化和抑癌基因的失活。Ki-67是重要的核增殖标记基因，在正常组织中的分布可反映细胞的动力特点。其在扁桃体的生发中心细胞、睾丸组织的未分化精原细胞、上皮基底层细胞、外周血淋巴细胞中均有表达，与细胞增殖状态相关，多用于判断肿瘤的良恶性以及恶性程度、肿瘤分化程度、浸润深度、复发、转移等情况。有研究[7]结果显示Ki-67是评估恶性肿瘤治疗疗效和预后的重要分子标记物。Wang等[8]发现在从胃黏膜肠化生、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变至肠型胃癌逐渐进展的过程中，Ki-67表达阳性率逐渐升高。但有研究[9-10]发现，Ki-67阳性表达与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移无关，并不能作为判断胃癌预后的独立危险因素。p53是重要的抑癌基因，其突变是多种恶性肿瘤发生的重要原因之一。研究发现p53突变体可与野生型p53形成异二聚体，抑制野生型p53的抑癌功能[11]。有研究[12]发现突变型p53-R273H可抑制miR-27a的转录和表达，从而激活EGFR信号通路，使EGFR下游信号蛋白ERK1/2持续活化，促进细胞增殖和肿瘤的发生。野生型p53基因产物半衰期短，而突变型p53基因产物较稳定，故常规免疫组化法检出的p53蛋白均为突变型。本研究结果显示，随着胃黏膜病变程度的加重，Ki-67和突变型p53阳性表达率均呈逐渐升高的趋势。低级别上皮内瘤变与萎缩性胃炎伴肠化生组、高级别上皮内瘤变与低级别上皮内瘤变组之间Ki-67和p53阳性表达率相比差异均有统计学意义(P<0.05)。虽然早期胃癌组与高级别上皮内瘤变组之间Ki-67和p53表达阳性率无明显差异，但表达强阳性率升高。推测Ki-67、p53在胃癌的发生、发展进程中发挥重要作用，对判断病变的发展趋势具有重要意义。

表1 Ki-67在不同阶段胃黏膜组织中的表达

*与正常胃黏膜组织比较，P<0.05

表2 p53在不同阶段胃黏膜组织中的表达

*与正常胃黏膜组织比较，P<0.05

表3 P504s在不同阶段胃黏膜组织中的表达

*与正常胃黏膜组织比较，P<0.05

在胃癌和癌前病变组织中，幽门螺杆菌(Hp)感染与Ki-67和p53表达之间有一定的相关性。祁晓莉等[13]发现Hp感染的胃癌和癌前病变组Ki-67表达率明显高于非Hp感染组，其机制可能是由于Hp感染可产生氧自由基和细胞因子，刺激胃黏膜上皮细胞增殖；或是由于Hp感染直接导致胃黏膜损伤，进而引起胃黏膜上皮细胞代偿性增生，最终可能通过诱发细胞增殖与凋亡的平衡失调而导致肿瘤的发生。国内外研究[14-15]发现，Hp感染与p53过表达有关，可能是由于Hp感染使野生型p53转变为突变型p53，导致p53丧失抑癌活性，从而促进细胞的恶性转化。本实验未进一步观察Hp感染与Ki-67、p53表达的关系，后续将进一步研究在胃黏膜癌变过程中Hp感染是否参与了细胞增殖分化的过程。

P504s在前列腺癌、骨髓、淋巴结、泌尿生殖系统和结肠肿瘤中均有表达。有研究[16]发现P504s蛋白在前列腺癌和前列腺高级别上皮内肿瘤中呈强阳性表达，而在前列腺增生组织中不表达。目前P504s在胃癌和癌前病变中表达的相关研究较少见。Lee[6]发现P504s在胃黏膜非肿瘤性上皮中呈弱表达，在异型增生和肠型胃癌中的表达明显升高。多项研究[17-18]发现P504s在胃高度异型增生和腺癌中的阳性率高于低度异型增生和不确定性异型增生，说明P504s可作为判断胃黏膜高度异型增生、低度异型增生以及不确定性异型增生的免疫标记物。吴凤婷等[19]发现P504s表达和分布与胃癌的发生、发展密切相关，可作为诊断胃癌的新候选分子标记物，胃镜下组织病理活检联合P504s检测可有效提高早期胃癌的检出率。陆勤平等[20]的研究结果显示P504s表达与胃癌Lauren分型和分化程度密切相关，可能参与了胃肠型腺癌的发生。本研究结果显示从正常胃黏膜-萎缩性胃炎伴肠化生-低级别上皮内瘤变-高级别上皮内瘤变-早期胃癌的发展过程中，P504s阳性表达率逐渐上升，其中高级别上皮内瘤变与低级别上皮内瘤变组的阳性表达率相比差异有统计学意义(P<0.05)，而早期胃癌组与高级别上皮内瘤变组相比无明显差异(P>0.05)，但表达强阳性率显著高于高级别上皮内瘤变组。与黄文斌等[18]的研究结果基本一致。李媛[21]认为联合p53过表达、表面上皮和小凹Ki-67增殖指数增高和P504s高表达有助于胃黏膜上皮异型增生的诊断。

总之，本研究结果表明Ki-67、p53、P504s在胃黏膜中的阳性表达率随着病变严重程度的增加而逐渐升高，强阳性率亦逐渐增高，提示上述三个指标可能参与了胃癌发生的早期过程，且与病变进展相关，监测其表达可用于对胃黏膜癌前病变的监测。对于表达阳性的萎缩性胃炎伴肠化生、低级别上皮内瘤变患者需密切随访观察，对于表达阳性的高级别上皮内瘤变患者需积极给予治疗。同时对仅靠细胞形态学无法准确判断是否存在胃黏膜上皮内瘤变或无法准确进行上皮内瘤变病理分级的病例，可提供辅助诊断依据。P504s在胃癌和癌前病变中的研究较少，本研究推测P504s可作为胃癌前病变和早期胃癌的新分子标记物，对鉴别低级别上皮内瘤变和高级别上皮内瘤变有一定的参考意义。综上所述，联合检测Ki-67、p53、P504s表达可能有助于判断胃癌前病变的严重程度以及预测病变的发展趋势，有利于提高胃癌前病变和早期胃癌的检出率。