四倍体鸭茅产量及其构成因素的QTL定位

唐露，黄琳凯，赵欣欣，张旭，聂刚，张新全，马啸

(四川农业大学动物科技学院，四川 成都611130)

牧草育种工作一直致力于提高产量和改良品质，大多数牧草以收获地上营养体为主要目的，因此育种家们常把与产量性状密切相关的一些表型特征，如株高、分蘖数、叶片长度等作为主要的育种目标[1]。由于产量性状是由微效多基因控制的数量性状，表现为连续变异，受环境的影响较大, 仅仅依靠常规育种方法在现有基础上难有大突破。近年来，分子生物技术的发展为作物育种带来了新鲜活力，分子标记的开发、分子遗传图谱的构建及QTL定位技术的发展为探究多基因控制的数量性状提供了有力的研究手段[2-4]。鸭茅(Dactylisglomerata)又名鸡脚草或果园草，隶属于禾本科(Gramineae)鸭茅属(Dactylis)，全属仅一个种，即鸭茅，其基本染色体数目为2n=14，有二倍体、四倍体和六倍体，其中用作饲草的多为四倍体[5]。鸭茅作为一种优良的冷季型牧草，具有叶多高产、耐阴、再生性强、适口性好、营养价值高等优点，可用于青饲、调制干草或青贮，是世界温带地区四大广泛分布的禾本科牧草之一[6-7]。早有研究表明，鸭茅的干物质产量与株高、叶长和分蘖数呈显著正相关[8]。鸭茅的单株产量及其构成因素是复杂的数量性状，通过对产量及其构成因子的QTL(quantitative trait locus)定位研究与分析，确定其在染色体上的位置及其遗传效应，可提高对产量性状优良基因型选择的预见性、准确性。

分子标记技术和QTL定位分析已大量应用于主要牧草，如紫花苜蓿(Medicagosativa)、多花黑麦草(Loliummultiflorum)、高丹草(Sorghumbicolor×S.sudanense)、冰草(Agropyroncristatum)等的重要农艺性状基因定位研究，包括产量和品质、抗病性、耐受性及繁殖性状等，并利用取得的部分成果对品种进行了遗传改良[9-12]。相比之下，鸭茅分子生物学方面的报道，多为种质资源遗传多样性分析、遗传距离估算及指纹图谱构建等方面，有关分子遗传图谱构建特别是产量等重要农艺性状的QTL定位研究报道极少[13-14]。目前世界上已报道4张鸭茅分子遗传图谱，但基因定位研究却仅限于繁殖相关性状。Xie等[15]利用SSR和AFLP标记共检测到7个与鸭茅抽穗期相关的QTL，解释的表型变异范围为7.85%～24.19%。Zhao等[16]则采用SLAF标签及SSR标记鉴定到与抽穗及开花显著相关的11个QTL，并通过功能注释筛选到两个候选基因hd1及VRN1。此外，育种家们较为关注的产量、品质及生长相关的农艺性状QTL研究尚未见报道。本试验在已构建的四倍体鸭茅分子遗传图谱基础上，拟对株高、旗叶长、旗叶宽、倒二叶长、倒二叶宽、茎粗、花序长、分蘖数、单株干重等9个产量相关性状进行了QTL分析，旨在确定控制这些性状显著相关的QTL数目及其遗传效应，为鸭茅遗传改良、功能基因挖掘、基因克隆及分子标记辅助育种等提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料及试验地概况

试验材料包括母本“楷模”(高秆、多分蘖、宽叶、早熟)和父本“01436”(矮秆、少分蘖、细叶、晚熟)及其杂交而成的214株作图群体。2012年将母本楷模和父本01436材料杂交，获得F1种子，并于温室发芽，2个月后提取材料DNA，利用SSR分子标记进行杂交种真实性鉴定，将F1代群体材料移栽至四川农业大学雅安(38°8′ N, 103°14′ E，海拔600～620 m，年均温16.0 ℃，年均降水量1015.2 mm，年平均日照时数1161.5 h，年平均无霜期283 d)试验基地中。2013年选取长势良好且存在差异的F1单株杂交获得包含214个单株的作图群体。试验点分别为四川省雅安市宝兴县及眉山市洪雅县。雅安宝兴地处东经120°51′-120°53′，北纬30°12′-30°18′，海拔750～1000 m，属四川盆地亚热带季风气候，年均温16.0 ℃，年均降水量993.7 mm，年平均日照时数789.4 h，年平均无霜期319 d。洪雅地处东经102°49′-103°32′，北纬29°24′-30°00′，年降水量1435.5 mm，属中亚热带湿润气候，年平均日照时数1006.1 h，年平均无霜期307 d。

1.2 农艺性状观测

采用分株克隆的方式将种于四川农业大学草学基地资源圃的群体材料取样均分后，于2014年10月分别种植于洪雅和宝兴两地，行距和株距均为50 cm，两地管理方式一致，当年成苗，但不抽穗。翌年春季开始逐步抽穗，并于盛花期观测株高(plant height,PH)、旗叶长(flag leaf length,FLL)、旗叶宽(flag leaf width,FLW)、倒二叶长(second leaf length,SLL)、倒二叶宽(second leaf width,SLW)、茎粗(stem diameter,SD)、花序长(inflorescence length,IL)、分蘖数(tiller number,TN)、单株干重(dry weight per plant,DW)共9个性状。亲本及每个群体单株随机选取3个分蘖，进行相关性状测定。由于这些表型性状的调查易受主观因素和环境的影响，因此在调查农艺性状时应统一调查标准，具体方法详见表1。且同一性状尽量一个人一次性调查完毕，以此来减少主客观因素造成的误差。

表1 农艺性状的观测Table 1 Observation of agronomic traits

1.3 数据统计与分析

采用Excel 2010对所有表型值进行汇总统计。用SPSS 19.0软件对鸭茅双亲进行差异显著性分析，对群体9个农艺性状表型值进行表型变异分析、正态分布检验、各性状相关性及主成分分析。

利用前期构建的四倍体鸭茅高密度分子遗传连锁图谱，采用MapQTL 5.0软件进行产量及其相关性状QTL分析。通过区间作图法(IM)定位性状，用PT检验1000次设定阈值，首先考虑0.99置信度对应的LOD(likelihood of odd)阈值，若没有定位区间则考虑0.95置信度对应的LOD阈值,若没有定位区间则考虑0.90置信度对应的LOD阈值。对PT检验未关联到区域的性状则手动降低阈值到3.0；若3.0没有区间则降到2.5，2.0。QTL命名参照McCouch等[17]的方法，即：q+目标性状(大写英文字母)+所在染色体号数或连锁群代号+QTL个数。

2 结果与分析

2.1 各性状在双亲间的差异及在群体中分离

表2对双亲和214个群体材料在两个试验点的性状表型进行了汇总。可以看出，除了茎粗在洪雅试验点表现无差异外，其余8个性状在两个亲本间均差异显著(P<0.05)，故可用该作图群体获得控制这些性状的QTL。总体而言，母本“楷模”各产量相关性状表现优于父本“01436”，但洪雅试验点旗叶宽的表型值“01436”略优于“楷模”。

从9个性状在群体中的变异幅度看，都存在明显的超亲分离，其分布范围均在双亲差异的范围之外。由于洪雅试验点当年虫害原因，整体长势较宝兴差。各性状表型值在两地略有不同，其中，洪雅试验点旗叶宽、倒二叶宽、茎粗和宝兴试验点旗叶宽、倒二叶宽的群体平均值低于“01436”，表现出负向超亲优势；而宝兴试验点花序长、茎粗的群体平均值高于“01436”，表现出明显的超亲优势；株高、旗叶长、倒二叶长、花序长、干重和分蘖数其群体均值在两地均介于双亲之间。

除洪雅试验点花序长和宝兴试验点倒二叶宽偏差较大外，其余性状在群体中分布的峰度和偏度绝对值均小于1，这是由多基因控制的数量性状遗传的典型分布，正态分布检验也表明9个农艺性状在群体中基本呈连续的正态分布，能够进行QTL定位分析。

表2 鸭茅亲本及群体产量及其相关性状表型值Table 2 Phenotypic values of parents and populations for yield relative traits of orchardgrass

2.2 群体材料中各性状间的相关性

相关性分析表明，两地单株干重与株高、旗叶长、倒二叶长、花序长、分蘖均极显著正相关(P<0.01，表3)。总体来看，与单株干重相关性较高的是株高和分蘖，相关系数分别为0.599、0.459(株高)和0.424、0.431(分蘖)。其次，与单株干重密切相关的依次为旗叶长和倒二叶长，表明分蘖、株高和叶长是鸭茅最为重要的产量构成因素，在育种工作中应加以重视。单株产量相关性最高的株高同其他性状的相关性在两地表现略有差异，与倒二叶长、茎粗和花序长都表现出显著的正相关关系，与旗叶宽、倒二叶宽表现出一定程度的负相关，并在宝兴试验点达到极显著水平；在宝兴试验点与其达到极显著正相关的旗叶长在洪雅试验点却并未表现出明显相关性。值得注意的是，同样与产量密切相关的分蘖与株高却在宝兴试验点达到极显著负相关。此外，分蘖除了在宝兴试验点与旗叶长、倒二叶长、旗叶宽表现出极显著正相关外，与其他性状的相关性都不高。

2.3 产量性状的主成分分析

以单株干重为因变量，其他性状为自变量，进行了产量相关性状的主成分分析。首先对两地的F2群体表型值进行KMO及Bartlett检验，洪雅、宝兴试验点的KMO统计量分别为0.665、0.677(KMO>0.5即可做主成分分析)，相应的概率Sig均为0.000，表明测试因子适合做主成分分析。在测试的8个因子中，两地的分析结果较为一致，特征值大于1的为前3个主成分，在洪雅、宝兴试验点的累积贡献率分别达到73.67%和79.71%，反映了总体数据的大部分信息。其中，第1主成分分别占比41.23%、39.45%(表 4)，分析结果较为一致，其中旗叶长、倒二叶长、花序长在第1成分矩阵中的值都较高，达到0.7以上(表5)，主要集合了鸭茅的叶部形态的部分因素，而且矩阵中特征值都较高，由于叶长、花序长与单株产量极显著相关，该成分有可能反映控制鸭茅产量的主要因素，此外矩阵中大多数特征值相差都不大，同时也反映了单株产量作为数量性状受多个性状影响的遗传特点；第2主成分在两地的代表变量差异较大，洪雅试验点为株高，而宝兴则为旗叶宽、倒二叶宽；第3主成分在两地的代表变量为株高和分蘖。

表3 鸭茅群体产量及其相关性的相关系数Table 3 The correlation coefficients for yield relative traits in population of orchardgrass

注： “*” 和“**”分别表示0.05和0.01显著水平。

Note：“*”and“**”represent significance levels of probability at 0.05 and 0.01, respectively.

2.4 鸭茅9个产量相关性状QTL定位

对两个不同环境下鸭茅9个产量相关性状QTL分析发现，控制这9个农艺性状的QTL总共60个，其中洪雅38个，宝兴22个(表6)，这些QTL分别定位于分子连锁图谱的1、2、3、4、5共5个连锁群中，单个QTL的贡献率为5.7%～24.7%，贡献率大于10%的QTL16个，单个性状QTL个数为2～15个。

2.4.1洪雅产量相关性状QTL定位 洪雅试验地共检测到9个性状的38个QTL，分布于除2、6、7以外的其余4个连锁群，LOD值介于3.03～8.58，解释的表型变异贡献率为6.9%～20.9%，其中表型贡献率大于10%的QTL有6个。第1、4连锁群上共检测到8个影响株高的QTL，其中1个位于第1连锁群，其余7个位于第4连锁群。检测到位于第1、5连锁群控制旗叶长的QTL共11个，8个位于第1连锁群，3个位于第5连锁群，其中qFLL-1-6 LOD值为4.52，贡献率较高为10.1%。控制倒二叶长的QTL共3个，同样位于1和5连锁群。与旗叶宽、倒二叶宽相关QTL都只有一个，皆位于第3染色体上的重复标记区间35.727～40.157 cM内，且两个QTL的贡献率都较高，其中qFLW-3-1为16.5%，qSLW-3-1为20.9%，表明该区间内极有可能存在控制叶宽的主效QTL。控制茎粗的QTL有2个，位于第3连锁群上的不同区间，贡献率分别为8.8%和11.0%。 检测到7个影响花序长的QTL，位于第1、3、5连锁群，其中贡献率大于10%的有2个。与分蘖相关的QTL检测到1个，位于第5连锁群，LOD值为3.03，贡献率较低6.7%。检测到位于第4连锁群上控制单株干重的QTL共4个。

表4 鸭茅群体材料产量相关性状的特征值、贡献率和累积贡献率Table 4 Eigenvalue and accumulative contribution rate for yield relative traits in population of orchardgrass

表5 鸭茅产量相关性状前3个主成分的因子负荷矩阵Table 5 Matrix among for yield relative traits in F2 population of orchardgrass

2.4.2宝兴产量相关性状QTL定位 宝兴试验地检测到的22个QTL中，表型贡献率大于10%的有10个，其中第1连锁群上与倒二叶宽相关的QTL贡献率最高为24.7%。在第2、4连锁群上分别检测到2个与株高相关的QTL，并且检测到两个重复的QTL，qPH-4-4和qPH-4-5。控制旗叶长的QTL共有4个，都位于第1连锁群上，且4个QTL的贡献率都较高，介于11.3%～12.3%。与倒二叶长、旗叶宽、倒二叶宽相关的QTL都只检测到一个，分别位于1、3连锁群，其中qSLL-1-3贡献率较高为12.1%，而qSLW-3-2贡献率高达24.7%。影响茎粗的2个QTL位于第3连锁群的0 cM及5.006 cM处，该两处位置分别含有5和3个标记。宝兴试验地与花序长相关的QTL共检测到5个，第1连锁群3个、第5连锁群2个，其中有3个QTL贡献率大于10%，qIL-1-4为17.9%，qIL-1-5为13.7%，qIL-5-3为11.1%。影响分蘖的QTL共检测到2个，位于第1连锁群。与单株干重相关的QTL共2个，分别位于第2、5连锁群。

注：“HY”和“BX”分别表示洪雅和宝兴基地。

Note: “HY” and “BX” represent the experimental site of Hongya and Baoxing, respectively.

3 讨论

3.1 产量及其构成性状的相关性分析

Sagsoz等[18]研究表明，鸭茅的干物质产量与株高、叶长和分蘖数呈显著正相关，这些性状对牧草产量贡献最大。其他禾本科牧草相关研究也得出了相似结论，Lemus等[19]研究发现，柳枝稷(Panicumvirgatum)的干物质量与株高呈极显著正相关，而逯晓萍等[20]则得出了不同生境下高丹草与株高、分蘖、茎粗、叶长、叶宽均呈现极显著正相关的结论。本研究利用两个四倍体鸭茅基因型“楷模”ד01436”组合而成的作图群体，对在两个不同生境下的产量及其相关性状的相关性进行了探讨。相关性分析表明，在两个不同的生境下，大多数农艺性状都与单株产量呈极显著正相关，与前人研究结果相一致。因此，从理论上讲，提高株高、分蘖数、增加花序长度和叶片长度，以及增大茎粗，可以提高单株产量。但由于性状之间相互联系并非彼此独立，因此在实际育种中，尤其是在有限的自然资源条件下，过于追求某些性状优良表现可能会增加育成品种的种植风险。例如与单株产量相关性最高的株高和分蘖，有相关研究表明[12]，两者呈负相关，本研究中在宝兴试验点得出了同样的结论，甚至达到了极显著负相关水平。且株高与叶宽也呈负相关，所以，不可过于追求植株高度的提高，要考虑性状之间的相互联系，选育植株高大，同时分蘖多、叶片宽大、叶量丰富表现良好的综合品种。

3.2 QTL的稳定性

大量研究表明，微效多基因控制的数量性状极易受外界环境的影响，通常控制同一性状QTL的数目、位置、效应及稳定性在不同遗传背景群体中表现不同，同一群体在不同年际、不同生境下的定位效果也不尽相同[21-22]。本研究中，同一群体在不同环境下检测到的QTL差异很明显。9个农艺性状在两地间共检测到60个QTL，遗憾的是重复检测到的仅有控制株高的qPH-4-4和qPH-4-5，两地的贡献率分别为7.8%、8.1%，表明该QTL在不同环境和条件下表现较为稳定，这些对环境不敏感且效应较大的QTL对分子标记辅助育种有较大利用价值。但从实际应用角度来讲，贡献率都较低，该位点对鸭茅高产育种应用价值有待进一步研究。其余8个性状在两地都没检测到相同的QTL，表明这些性状遗传稳定性不高，受环境影响较大，也可能是由于控制这些性状的QTL分布较广，数量较多，在不同环境条件下起作用的QTL不同。想要找到稳定控制性状的主效QTL，还需设计多年多点试验，或者构建不同遗传背景的群体材料加以验证分析。

3.3 QTL的多效性和QTL簇

QTL的多效性指同一区间检测到的QTL同时调控几个性状的表达，这种情况在动植物中都普遍存在[23-25]。本研究的结果证实了多效性QTL的存在。如第3连锁群上qFLW-3-2、qSD-3-4和qIL-3-2均在5.006 cM处，表明Marker33554很有可能存在一个同时控制旗叶宽、茎粗、花序长的QTL；第3连锁群上的qFLW-3-1和qSLW-3-1都分布在区间35.727～40.157 cM处，且两者的贡献率都较高，分别是16.5%和20.9%，表明该位点可能存在一个效应值较大的多效性主效QTL；第3连锁群上的控制茎粗与花序长的qSD-3-1、qIL-3-4也存在同样的效应。此外，从本研究的结果来看，洪雅基地所检测到的38个QTL中，有21个分布于第1、3连锁群，占所检测到QTL的55.3%；同样，宝兴试验点检测到的22个QTL中，有14个主要集中在第1、3连锁群，占所检测到QTL的63.7%，其余8个QTL分散在其他3个连锁群上。本研究中，这些成簇分布的多效QTL同时调控的几个性状都存在着显著正相关，恰好也为性状间的相关性提供了一定解释。相关性状的QTL通常定位于同一连锁群上相同或者相近区域，这可能是一因多效或由于基因紧密连锁于同一区间或基因重叠造成[26]。近年来，QTL的成功克隆与功能研究也验证了QTL的一因多效性，例如水稻(Oryzasativa)中QTL-Ghd7同时调控抽穗期、株高和每穗粒数；小麦(Triticumaestivum)中QTL-Gpc-B1等对小麦蛋白质、锌、铁含量均有影响；调控玉米(Zeamays)株型相关性状的QTL-ZmGA3ox2[27-29]。这些与产量相关性状的QTL富集区域的发现，对鸭茅分子育种有重要作用，尤其是本研究检测到的第1连锁群上控制旗叶长和第4连锁群上控制株高的QTL富集区域，数量多，且贡献率较高，如果对这些遗传区域进行深入研究，挖掘与主效QTL紧密连锁的分子标记，就可以直接用于鸭茅产量相关性状的分子标记辅助选择。