川渝地区胆腑郁热型鼻渊患者鼻腔分泌物含量与证候研究*

窦豆 谢慧 张锋 李玲珑

慢性鼻-鼻窦炎（chronic rhino-sinusitis，CRS）是由致病菌引起的鼻腔鼻窦黏膜的慢性炎症，是耳鼻咽喉科常见的慢性感染性疾病之一，是宿主和环境多因素相互作用的结果。研究证实鼻窦炎的反复发作以及难治愈性与鼻-鼻窦细菌生物膜形成有关[1，2]。鼻腔菌群通过相互影响，作用形成生物膜，加大了鼻窦炎的治愈难度，在此过程的调控机制中，目前许多微生物研究表明密度感应系统(quorum sensing)，是微生物群体信息传递的机制，细菌间通过分泌化学信号分子自诱导物(autoindueer，AI)调控菌属种群密度及结构基因表达，进而引起生理行为改变[3，4]。鼻腔中存在杆菌，球菌，革兰阴性菌及阳性菌等各种细菌，为形成生物膜提供条件，使得慢性疾病迁延难愈。

为探讨CRS患者鼻腔中细菌表达情况，使用鼻腔分泌物离体分离培养技术，结合双抗体夹心酶联免疫法检测胆腑郁热型鼻渊患者鼻腔菌群及窦口鼻道复合体分泌SigA与正常人之间的差异，通过统计学分析，正常人与患者之间差异性，为临床实践提供思路，为细菌生物膜的研究进行铺垫，现具体报告如下。

资料与方法

1 病例收集

选取2015年11月～2016年5月期间重庆市永川区中医院及成都中医药大学附属医院耳鼻咽喉科门诊符合西医慢性鼻-鼻窦炎诊断标准[5]（2012，昆明）以及根据中国中医药出版社2012年出版的“十二五规划教材”《中医耳鼻咽喉科学》[6]中胆腑郁热证的辨证诊断标准，中医证候量化评分在5～9分之间，未行手术治疗，近2月未使用抗生素、糖皮质激素口服及喷鼻剂治疗，性别不限，年龄在18～60岁之间，自愿受试患者。

2 取样及实验方法

严格按照技术操作规范，充分消毒内窥镜，带无菌手套，以无菌棉拭子置于受检者的中鼻甲下外侧即中鼻道，旋转2周半擦取黏膜表面菌群，整个取样过程避免接触鼻腔侧壁及鼻前庭。采得样本置于3mL塑料EP管中，管内含有1.5ml还原性硫乙醇酸盐转运液。转移样本于4℃保存不超过24小时，于成都中医药大学附属医院检验科进行细菌培养及优势细菌鉴定。

3 ELISA标本备制及试验

将装有原始样本的离心管置于震荡机1min，使棉拭子上的细菌脱落于转运液中，后丢弃棉拭子。再将离心管置于高速离心机中，8000rpm，10min后，用移液枪吸取上清液140ul，-40℃冻存。用于ELISA法检测取窦口鼻道复合处黏膜分泌物生物酶SigA含量，每个标本制作3个附孔，取平均值进行统计。

4 观察指标

4.1 细菌鉴定

使用血平板进行细菌培养，培养72小时后挑取单一菌落进行优势菌种鉴定，使用法国生物梅里埃全自动微生物鉴定系统（型号VITEK2compact）鉴定优势菌。

4.2 使用，ELISA试剂盒（南京建成，人分泌型SIgA）检测鼻腔黏膜分泌物SigA浓度，在全波长酶标仪（Thermo Fisher）450mm 检测。

结果

1 进行病例证型分析统计时发现，成都地区胆腑郁热型鼻渊纳入患者约占鼻渊患者就诊人数25.3%，永川地区胆腑郁热型鼻渊纳入患者约占鼻渊患者就诊人数22.5%。

2 根据ELISA标准曲线计算出每个样本OD值对应浓度。通过线性式及多项式方法计算标准曲线计算发现R=0.999＞0.99,实验精确误差小，可用于统计。ELISA标准曲线如图1。

图1 ELISA标准曲线

3使用SPASS 17.0进行数据分析，发现研究数据符合正态分布，且方差齐，使用t检验，发现鼻渊患者与正常人鼻腔分泌物SigA浓度，存在显著差异（t=3.863，P=0.003＜0.05），具有统计学意义。

4 不同地区（成都和重庆永川区）CRS患者之间鼻腔分泌物SigA含量，经过统计学分析P＞0.05），无统计学差异。不同地区正常人鼻腔分泌物SigA含量之间，P＞0.05，差异无统计学意义，如表1。

表1 慢性鼻窦炎患者与正常人鼻腔分泌物SigA含量对比

讨论

1 川渝地区患者与正常人，鼻腔分泌物SigA含量差异无统计学意义。不同地区人群鼻腔与外界相通虽然受空气，粉尘，污染物等大气因素的影响，但对鼻腔黏膜细菌分泌物的影响可以忽略不计，且取样时间涉及一年四季，从另一个方面证实至少在成都及重庆地区，外界环境对于鼻腔微环境的影响可以忽略不计，可以推广使用同一种安全有效的治疗方案。南北方差异，以及长江流域，黄河流域差异问题有待进一步大样本研究。

2 成都及重庆永川地区慢性鼻-鼻窦炎患者与正常人鼻腔黏膜分泌物SigA差异具有显著统计学意义。在实验过程中发现，取鼻腔菌群进行离体培养与鉴定时发现，鼻窦炎患者鼻腔菌群生长更快，菌群种类相对于正常人而言更多样化，60小时就可铺满直径为10mm血平板。通过微生物细菌鉴定，发现两个地区鼻窦炎患者中约3%为链球菌，4%肺炎球菌及巴氏葡萄球，6%类白喉棒状杆菌，12%为金黄色葡萄球菌，61.1%为表皮葡萄球菌，细菌种属过少无法确切鉴定出菌种约占9.8%；正常人中约65%为表皮葡萄球菌，30%为金黄色葡萄球菌。鼻腔菌群与正常人对比而言，菌种类繁多，菌落生长较快。

3 纳入慢性鼻窦炎患者时使用，鼻渊胆腑郁热证中医标准证候评分，发现患者平均评分为6.5分（患者平均年龄36.5岁，男32例，女40例），评分越高则鼻腔内SigA浓度越高，说明鼻腔菌群的多少，细菌对于鼻黏膜的影响与患者病情呈正相关。

4 通过预实验及正式实验，综合各类减少实验误差的方法[7]，探究发现SigA浓度与细菌浓度有关，与分泌物量无关。此项结论可以解释，鼻腔大小与形成病理疾病关系甚小，疾病形成多与鼻腔结构有关。

对鼻渊患者鼻腔细菌菌种及黏膜分泌物SigA含量的研究，为研究鼻腔细菌生物膜做铺垫，治疗胆腑郁热型鼻渊中成药鼻渊舒口服液，在对抗细菌生物膜上存在一定优势，通过后期研究，进一步论治细菌生物膜[8]在慢性鼻窦炎中的病理机制，详细研究生物膜群里感应型号AI-2在鼻窦炎患者中的表达情况，研究中药制剂对抗生物膜机制，更有效地发挥中医中药的优势作用。