中西医结合有效逆转乙肝肝纤维化的目标人群特征和作用机制

孙 鑫 彭 渊 吕 靖 赵志敏 杨 涛 陶艳艳 胡旭东 刘成海,

(1 上海中医药大学附属曙光医院肝病研究所，上海，201203； 2 上海市中医临床重点实验室，上海，201203； 3 上海中医药大学基础医学院生物教研室，上海，201203)

慢性乙型病毒性肝炎是严重威胁人类健康的重大传染性疾病之一。近年来，随着疫苗接种与抗病毒药物广泛应用，慢乙肝的治疗取得了巨大进展。但是，有效抑制乙型肝炎病毒(Chronic Hepatitis B，HBV)后，肝纤维化肝硬化等后期阶段疾病依然存在，目前尚无抗肝纤维化生物或化学药物，中医药具有抗肝纤维化的独特优势，抗乙肝病毒药物与抗肝纤维化中药联合应用可促进乙肝肝纤维化逆转。探索并回答中西药物联用疗效提高的关键机制，中医药在其中的作用，其治疗应答的目标人群特征，将发现中西医结合方案有效逆转乙肝肝纤维化目标人群的主要生物学与中医证候特征，阐明中西医结合有效治疗乙肝肝硬化的主要原理及中药作用特点，建立临床与基础密切结合的中西医结合肝纤维化转化医学研究模式，促进基础研究与临床实践的共同发展进步。

1 肝纤维化是影响慢乙肝患者预后的重要病理特点，抗肝纤维化是中医优势领域，抗乙肝病毒药物与抗肝纤维化中药联合应用可促进乙肝肝纤维化逆转

肝纤维化以肝脏的细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)过度增生和异常沉积为特征，存在于大多数慢性肝病，是慢性肝炎向肝硬化发展的关键病理过程，可引起肝脏结构与功能异常，严重威胁患者健康。目前乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染依然是我国慢性肝病的主要原因，HBV介导的免疫应答致使肝细胞损伤与炎性反应反复存在[1]，促使患者进展为肝硬化甚或肝癌。针对HBV复制的病因治疗可部分减轻与逆转肝脏纤维化[2-3]，但作用有限。乙肝患者在恩替卡韦(Entecavir，ETV)等核苷酸类治疗1年的肝纤维化改善率仅为39%，部分患者病毒有效控制后肝纤维化依然存在或者发展[4]；对于初始治疗时纤维化显著的慢乙肝高度肝纤维化或肝硬化患者，即使疗程延长到5～10年，仍有1/3患者肝纤维化未能改善[5-6]。究其原因，主要有以下几个方面：其一，肝星形细胞(Hepatic Stellate Cell，HSC)一旦活化可自分泌多种细胞因子维持活化的持续；其二，肝脏微环境破坏，如肝组织炎性免疫细胞迁移、表型与功能异常，导致肝脏细胞与细胞、细胞与基质间复杂病理影响；其三，沉积的ECM降解减少。因此，对于乙肝肝硬化患者，抗病毒治疗是必须的，而针对HSC的活化与ECM代谢的抗肝纤维化治疗也是必要的。

近半个世纪来，我国中医中西医结合肝病工作者面对临床需求，开展了大量临床与基础研究，出现了抗肝纤维化中成药、经验方或中西医结合方案，阐明了有效方药的部分作用机制，形成了全国行业性中西医结合肝纤维化诊疗指南，并且进行了中医药抗肝纤维化的美国FDA临床注册试验等，这些成绩与进步，使得肝纤维化治疗成为中医中西医结合领域的优势方向。由丹参、桃仁、虫草菌丝、松黄、五味子、绞股蓝组成的扶正化瘀方(Fuzheng Huayu Formula，FZHY)，是上海中医药大学肝病研究所研制的抗肝纤维化中药新药。文献荟萃分析发现，FZHY联合抗病毒药物可改善乙肝肝纤维化患者症状与血清纤维化指标[7]。我们与瑞金医院感染科合作开展的FZHY联合ETV治疗乙肝肝纤维化小样本、随机、双盲、安慰剂平行对照临床试验结果显示，FZHY联合ETV治疗48周，肝组织学逆转率显著高于单用ETV组。2014年在国家传染病重大科技专项(2014ZX10005001)支持下，我们课题组牵头联合全国20家临床医院开展了中医药联合ETV治疗乙肝肝硬化的大样本临床研究，旨在较大规模、高质量获得中医药逆转高度肝纤维化的循证医学证据，建立有效的临床方案，促进肝纤维化治疗这一世界性医学难题的逐步解决。

2 乙肝早期肝硬化患者存在肝脏区域免疫微环境紊乱的病理特征，是影响高度肝纤维化难以消退逆转的重要原因

肝纤维化具有形成发展与消退恢复2个阶段。既往认为，肝纤维化一旦形成，则难以逆转。但近年来研究证实，不仅肝纤维化是可逆的，一定程度的肝硬化也是可逆的[8]。无论肝纤维化的发展还是消退，其机制均十分复杂，涉及到肝实质细胞损伤、HSC的活化、自然杀伤细胞(Natural Killer Cell，NK细胞)与肝巨噬细胞(Macrophage，Mφ)(包括库普弗细胞)的功能异常、ECM的代谢失衡等多个方面。乙肝肝硬化患者肝脏高度纤维化，而活化HSC的凋亡消退与肝脏沉积ECM降解是高度肝纤维化逆转的重要环节，该环节涉及到NK细胞与Mφ(包括库普弗细胞)的免疫调节、HSC的视黄醇代谢等，且这些细胞相互联系，构成影响肝纤维化逆转的“免疫微环境”。见图1。

HSC是肝纤维化的关键效应细胞，也是肝内重要的免疫调节细胞与机体视黄醇代谢关键细胞，且这种视黄醇代谢与HSC活化及其免疫调节有重要联系。静止期HSC胞内主要为视黄醇，细胞活化时，视黄醇在乙醇脱氢酶作用下变为视黄醛，视黄醛既可通过短链脱氢酶/还原酶再逆转化为视黄醇，也可通过乙醛脱氢酶转变为视黄酸(Retinoid Acid，RA)。RA则可进入核内与其核受体相结合，调控目的基因表达，而完全活化的HSC脂滴消失，缺乏视黄醇与RA。有研究表明：视黄醇代谢酶ADH3可刺激I型胶原基因表达与转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1)活化，有明显的促进肝纤维化作用[9]。

图1 肝纤维化“免疫微环境”示意图

人肝内NK细胞占淋巴细胞比例高达30%～50%，在肝脏中优势存在，无需抗原提呈即可对多种靶细胞发挥细胞毒作用，并由其激活型与抑制型受体的平衡所决定。肝NK细胞与HSC联系密切，且与视黄醇代谢有关。一方面，NK细胞可“杀伤”早期活化与衰老的HSC，主要通过视黄酸早期诱导基因1(RAE-1)、干扰素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor Necrosis Factor-related Apoptosis-inducing Ligand，TRAIL)等途径[10]。另一方面，HSC作为免疫调节细胞负性调控NK细胞，主要通过细胞因子信号转导抑制因子1(SCOS1)、TGF-β1-Smads信号通路等途径抑制NK细胞的增殖分化[11]。因此，提高NK细胞的活性，使NK细胞杀伤活化HSC功能增强，是逆转肝纤维化的重要措施之一。

肝内Mφ数量众多，定居于肝脏的Mφ占全身组织定居Mφ总数的80%～90%[12]，是肝内重要的固有免疫细胞，在维持肝脏免疫稳态中发挥重要作用，其对肝纤维化有“双刃剑”作用。在肝脏炎性反应与纤维化形成阶段，肝内Mφ通过经典途径激活为促炎性的M1型，而在肝纤维化消退阶段，肝内Mφ通过旁路激活为恢复性或抗炎性的M2型。Mφ其主要通过明胶酶MMP-9、弹性胶原酶MMP-12、TRAIL及其受体等途径促进肝纤维化消退[13]，此外Mφ吞噬清除细胞凋亡碎片以及增强NK细胞活性，也有助于肝纤维化的消退。HSC也可影响Mφ的募集与分化，RA可促进肝内Mφ的活性[14]。因此，调控肝Mφ的分化，使Mφ更多的发挥恢复性亚群的功能，也是逆转高度肝纤维化的重要措施。

在慢性乙型肝炎或肝硬化时，NK细胞等免疫细胞活性下降。研究发现HBV感染可负调控NK细胞功能，如促使NKG2A等抑制型受体与共抑制分子Tim3表达增多[15]，而激活型受体表达下降，抑制树突状细胞与NK细胞间的细胞通信等，从而抑制NK细胞活性等。部分患者即使有效控制HBV复制，肝脏NK细胞仍处于抑制状态[16]，提示除了HBV因素，尚有抑制NK细胞等免疫细胞活性的其他因素。因此，探讨肝NK细胞等免疫逃逸的负性调节机制与干预作用，将有助于阐明肝纤维化的免疫病理机制、发展肝纤维化治疗新策略。

3 调节肝脏区域免疫微环境，调节活化HSC与肝脏免疫细胞之间联系可能是中医药逆转高度肝纤维化的优势

我国传统医学蕴藏着丰富的免疫学思想，《素问·六微旨大论》云“亢则害，承乃制，制则生化”。从免疫学角度而言，“亢则害”就是机体免疫自稳态失调；“承乃制”则是通过调控使免疫自稳功能恢复，机体生长代谢等生理功能正常，达到“制则生化”之境地。中药与免疫调节有着天然而紧密的联系：中药具有“扶正”功能，能够增强机体免疫功能，促进单核-巨噬细胞、NK细胞等生理功能；中药也具有“祛邪”作用，能够免疫抑制，减少炎性反应递质的释放，抑制或消除抗体的产生，抑制T细胞的增殖等，以达到“邪去而正安”的目的[17]。这种双向免疫调节作用正体现了中医“整体观”与“阴阳平衡”理念。

既往研究发现，FZHY抗肝纤维化的机制包括保护肝细胞损伤与促进肝细胞再生，抑制HSC活化，促进胶原降解等[18-19]；有研究提示其作用机制还与免疫调节有关：FZHY治疗肝硬化患者80例3个月，可有效提高患者外周血的NK细胞活性及T细胞数量[20]；FZHY可提高肝纤维化小鼠的肝脏NK细胞活性，而对ASGM-1抗体抑制体内NK细胞的模型小鼠抗肝纤维化效应减弱，证实其抗肝纤维化效应与激活NK细胞密切相关[21]；FZHY可通过抑制肝Mφ的激活及其旁分泌作用，而抑制HSC活化等[19]。我们也发现FZHY主要药物丹参与虫草菌丝抗小鼠肝纤维化的作用与提高肝脏NK细胞活性有关。这些结果均提示，FZHY可能具有调节NK细胞与肝Mφ等肝脏区域免疫的作用，与抗病毒药物协同作用，促进活化HSC凋亡与肝纤维化消退。

4 发现有效人群的生物学与中医证候特征，将有助于乙肝肝纤维化的精细分层与中西医结合精准治疗

疾病是环境与基因相互复杂影响的结果，常常具有异质性。例如，均为慢性丙型肝炎患者，但发展为肝纤维化的时间相差可达5倍，且IL28-B基因多态性可明显影响到患者对干扰素-α的临床疗效[22-23]。因此，需重视疾病分层，以准确判断预后，选择适应人群，精准医疗以提高临床诊治水平。

肝脏是机体的代谢器官也是免疫器官，因此肝脏疾病的异质性除了常用的代谢组学所表征，免疫学的变化也是重要表征特点。代谢组学可发现药物代谢组及其疗效预测的生物标志物，通过与转录组等相结合，可以构建生物分子网络，发现与交叉验证影响代谢的关键通路及其节点。肝脏虽不是“专职”免疫器官，但是其天然免疫优势存在，对于维护肝脏微环境稳定、肝脏疾病的发生变化及全身免疫反应调节等均发挥重要作用[24]。因此，基于影响乙肝肝纤维化消退转归的肝脏区域免疫关键病理，结合视黄醇代谢这一肝脏特有、与纤维化与免疫调节均密切相关的物质代谢，且联系全身的免疫蛋白质组变化，可以发现对治疗方案应答差异的免疫学重要特征。

中医证候是疾病过程中某一阶段机体在内外致病因素作用下的综合反应，中医重视辨证论治与病证结合，早在汉代《金匮要略》中即有《黄疸病脉证并治》等论述。《肝纤维化中西医结合诊疗指南》[25]指出：肝纤维化的基本病机为正虚血瘀，而主要证型有肝胆湿热、肝郁脾虚与肝肾阴虚，在辨证治疗时，主要证型与治法、基本证型与治法两者必须相互结合，灵活运用[26]。因此，在中医基本治法基础上，通过差异疗效的证候因素分层分析，可以发现影响疗效的中医主要证候，并了解基本证候的主要生物学基础。

5 科学假说的提出与主要工作思路

基于中医药抗肝纤维化的优势与免疫调节特点，重大专项乙肝早期肝硬化患者中西医结合方案的组间、组内疗效差异现象，肝脏区域免疫微环境在肝纤维化逆转中的重要作用，我们提出以下科学假说：1)调节肝HSC与NK细胞、肝Mφ之间相互联系，改善肝纤维化免疫微环境，是中西药物联用逆转乙肝高度肝纤维化的重要作用机制；2)中药扶正化瘀方的作用特点在于调节活化HSC的视黄醇代谢与转化生长因子(TGF)-β1信号转导，以恢复NK细胞的免疫杀伤功能；3)该被治疗药物改善的肝脏免疫微环境是有效人群的重要生物学表现，与机体血清代谢标志物及其中医证候构成效应目标人群的主要特征。

本研究将借助传染病重大科技专项的乙肝肝硬化临床研究生物样本，结合动物与细胞实验，围绕肝纤维化免疫微环境中HSC、NK细胞与肝Mφ的相互联系及其视黄醇代谢，临床与基础、区域免疫与整体变化等相结合研究，以验证以上科学假说，发现有效方案的目标人群特征，阐明其主要治疗机制与中药作用特点，促进中西医结合肝病的精准医疗与基础研究发展。