响应面法优化杏鲍菇液体发酵培养基

翟宏伟　陈晓明

摘 要：设计并通过响应面优化了一种适用于杏鲍菇（Pleurotus eryngii）液体发酵的新培养基TSM-1。以单因子试验筛选出指标具有显著影响的TSD-1微生物生长促进剂，液体多肽蛋白肥和NaCl，并通过Box-Behnken设计以及响应面分析得到了3因子最优添加量，形成TSM-1培养基的最优配方：葡萄糖40 g，酵母浸膏10 g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H4O 0.5 g，NaCl 0.15 g，复合维生素B片1片（市售OTC成药），添加TSD-1微生物生长促进剂0.3 g，钙蛋白2 g，蒸馏水1 000 mL，pH值 6.4，121 °C灭菌30 min。优化后TSM-1培养基中杏鲍菇菌丝生物量可达18.70 ±0.03 g·L-1。

关键词：杏鲍菇；培养基；优化；响应面

中图分类号：S646 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.09.014

Optimization of Pleurotus eryngii Liguid Fermentation Medium by Response Surface Methodology

ZHAI Hongwei， CHEN Xiaoming

（Tianjin University of Science & Technology， Tianjin 300457，China）

Abstract： A new Pleurotus eryngii liquid culture medium named TSM-1 was designed and optimized by response surface methodology. Three factors were selected by single factors experiment including TSD-1 microbial growth promoter， liquid protein fertilizer and NaCl. The optimum additive amounts of three factors were determined respectively by Box-Benhnken design and response surface analysis. The optimum formula of TSM-1 culture medium was as follows： glucose 40 g， yeast extractor 10 g， KH2PO4 1 g， MgSO4·7H4O 0.5 g， NaCl 0.15 g， multivitamin tablet1piece， addingTSD-1 0.3 g， liquid protein fertilizer 2 g， distilled water 1 000 mL， pH=6.4， sterilization at 121 ℃ after 30 min. Under the optimized TSM-1 medium， the biomass of Pleurotus eryngii was reached to 18.70±0.03 g·L-1.

Key words： Pleurotus eryngii； culture medium； optimization； response surface methodology

自1948年以来，利用液体层发酵技术培养各种食用菌引起人们的极大重视[1]。相对于食用菌的固体培养而言，液体培养既可以缩短培养周期又提高了培养效率，特别适合于食用菌的规模化、周年化、工厂化生产，要实现杏鲍菇的大规模商品化生产，应用液体菌种是必然。截至目前，有关杏鲍菇液体培养均集中于杏鲍菇对不同碳氮源的利用上，但有关生长促进剂在食用菌液体发酵培养基中的应用鲜有报道。

因此，笔者尝试设计并优化了一种新的适用于杏鲍菇的液体深层发酵培养基TSM-1，并添加了食用菌生长促进剂TSD-1、钙蛋白制剂、渗透压调节剂NaCl，以响应面法对TSM-1液体培养基中这3种特殊成分进行优化，以培养基中杏鲍菇菌丝的最大生物量为标准，确定了TSM-1液体培养基的最优配方，为食用菌生长促进剂在杏鲍菇液体深层发酵上的应用打下基础。

1 材料和方法

1.1 材 料

菌种杏鲍菇（Pleurotus eryngii）由天津市林业果树研究所保藏，编号：杏5。

种子及对照培养基为CM培养基配方为：葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，酵母浸膏1 g，KH2PO4 0.46 g，K2HPO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蒸馏水1 000 mL，pH值6.4，121 ℃灭菌30 min[2]。

测试培养基为自行设計的TSM-1液体培养基，具体配方为：葡萄糖40 g，酵母浸膏10 g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H4O 0.5 g，NaCl，复合维生素B片1片（市售OTC成药），TSD-1微生物生长促进剂，钙蛋白，蒸馏水1000 mL，pH值6.4，121 ℃灭菌30 min。

其中，TSD-1微生物生长促进剂由天津市天寿食用菌有限公司购得，主要成分为：己酸二乙氨基乙醇酯，精氨酸，牛磺酸。钙蛋白制剂，即液体多肽蛋白肥，由天津市纽艾格农业科技有限公司提供，主要成分为：氨基酸100 g·L-1，多肽50 g·L-1，Ca 30 g·L-1，Mg 10 g·L-1，Zn以及B 4 g·L-1。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计 通过确定因子数量的Plackett-Burman设计以及确定因子水平最佳组合区域的最陡爬坡预备试验[3]，筛选出TSD-1微生物生长促进剂的浓度范围为0.03%～0.04%，钙蛋白浓度范围为0.2%左右，NaCl浓度在0.1%～0.2%之间。采用Box-Benhnken（BBD）试验设计[4]，以TSD-1微生物生长促进剂添加量为因子A，钙蛋白制剂添加量为因子B，NaCl添加量为因子C，以发酵液中菌丝球最大生物量（干质量）为响应变量，进行因子水平的响应面分析试验，共生成17次独立试验，析因部分试验次数为12次，中心点重复试验为5次，响应曲面因子及水平见表1，试验计划见表2。

1.2.2 培养基的制备 各处理培养基配置并定容，以5% NaOH以及5% HCl调节pH值至杏鲍菇菌丝体最适pH值6.4[5-6]，装入250 mL广口三角瓶，每瓶85 mL，8层纱布封口并加盖双层牛皮纸，121 °C灭菌30 min，冷却后接种，CM液体培养基作为对照组，制备方法与测试培养基相同。

1.2.3 菌丝培养及生物量测定 取4 °C冰箱中保藏的杏鲍菇试管母种，置于25 °C恒温培养箱中活化48 h后，接种于CM液体培养基中，每瓶接种3小块。接种后摇瓶揭去牛皮纸并置于恒温摇床中，160 r·min-1，25 °C避光培养5 d，待液体培养基中出现细碎菌丝球时，经酚红肉汤无菌检查[7]后，用无菌移液管吸取5 mL种子液（接种量约5%），接种于测试培养基各处理以及对照培养基中，置于恒温摇床中，160 r·min-1，25 °C避光培养96 h，以菌絲体干重法[8-9]测定生物量并求取平均值。

1.3 数据统计与分析

通过软件Design-Expert.V8.0.6对试验数据进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 响应面试验结果

经过96 h的发酵后，各培养基处理配方及其重复中杏鲍菇菌丝的生物量见表2。由表2可以看出，处理3、5、10、13和17，即TSD-1浓度0.03%，钙蛋白浓度0.20%，NaCl浓度0.15%时，杏鲍菇菌丝体生物量最高，其均值在18.37～18.79 g·L-1之间，较CK提高了164.32%～170.36%。

2.2 模型建立及显著性分析

利用Design-Expert.V8.0.6对表2中的试验数据进行多元回归拟合[4]，则杏鲍菇菌丝在TSM-1培养基中发酵96 h后的生物量干质量（Y）对TSD-1微生物生长促进剂添加量（X1），钙蛋白添加量（X2），NaCl添加量（X3）的实际值全变量二次多项回归方程为：

Y=-23.318+439.959X1+164.530X2+32.923X3- 552.475X1X2+6.808X2X3-4 492.934X2 1 -391.326X2 2-116.016X2 3

对该回归模型进行方差分析结果见表3，回归模型系数的显著性检验结果见表4。

由表3可知，回归模型统计学效应极显著且拟合度良好，该模型方程可以解释97.8%的响应值（杏鲍菇菌丝体生物量）的变化，说明可以用该模型预测不同TSM-1液体培养基中添加物的含量与杏鲍菇菌丝生物量得率的最优解；但该模型的修正R2与预测R2之间尚有一定差距，表明不能使用该模型预测真实结果，尚需验证试验[10-11]。

从表4中可以看出，模型一次项表明除NaCl外，因子对杏鲍菇菌丝生物量的影响都达到了极显著（P<0.01）水平，3个因素影响的显著程度排列顺序为：钙蛋白添加量>TSD-1添加量>NaCl添加量；所有二次项对菌丝生物量影响亦达极显著水平（P<0.01）；根据各项F值大小，可知TSM-1液体培养基添加物在各因子的交互作用中，TSD-1×钙蛋白（X1×X2）>钙蛋白×NaCl（X2×X3）>TSD-1×NaCl（X1×X3），其中TSD-1（X1）与钙蛋白（X2）交互作用达显著水平（P<0.05），说明其响应值对菌丝生物量有显著影响（P<0.05），而其余交互项对响应值的影响均不显著（P>0.05）。

根据回归分析结果，对TSD-1×钙蛋白，钙蛋白×NaCl，TSD-1×NaCl各因素之间的交互作用对杏鲍菇菌丝生物量的具体影响进行作图（图1）。从图1可以看出，TSM-1液体培养基中，杏鲍菇菌丝生物量随着TSD-1微生物生长促进剂添加量和钙蛋白先增加后降低，显示出明显的碳氮比效应，且钙蛋白的影响较TSD-1明显。TSD-1与钙蛋白中都含有丰富的氮源，因此二者的交互作用主要体现在因子的不同组合引起的速效迟效氮的变化方面。

结合图1和表4，在TSM-1液体培养基中，交互作用钙蛋白×NaCl，TSD-1×NaCl几乎是不存在的，作为渗透压调节剂的NaCl，在高的葡萄糖含量（40 g·L-1）的TSM-1培养基中，其效应很可能被葡萄糖掩盖而无法显现。

2.3 验证试验

根据回归模型，通过软件分析得到上述3因子的最优添加量为：TSD-1微生物生长促进剂0.03%，钙蛋白0.2%，NaCl 0.15%，在此条件下，三次平行验证，TSM-1培养基中杏鲍菇平均菌丝生物量为18.70±0.03 g·L-1，与预测值吻合良好，为对照组CM培养基的2.7倍。

3 结 论

（1）TSM-1液体培养基具体配方优化为：葡萄糖40 g，酵母浸膏10 g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.15 g，复合维生素B片1片（市售OTC成药），添加TSD-1微生物生长促进剂0.3 g，钙蛋白2 g，蒸馏水1 000 mL，pH值6.4，121 ℃灭菌30 min。

（2）杏鲍菇菌丝在优化的TSM-1培养基中，160 r·min-1，25 °C下培养96 h后，其生物量为18.70±0.03 g·L-1，相当于传统CM培养基的2.7倍。

（3）NaCl在高渗的TSM-1液体培养基中对杏鲍菇菌丝影响不大。

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