山东省14例输入性卵形疟原虫wallikeri亚种的鉴定

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疟疾是由疟原虫引起的一种虫媒寄生虫病，是世界上危害最严重的热带病之一。寄生于人体的疟原虫有5种，即间日疟原虫(Plasmodiumvivax)、恶性疟原虫(P.falciparum)、三日疟原虫(P.malariae)、卵形疟原虫(P.ovale)和诺氏疟原虫(P.knowlesi)。随着全国疟疾消除计划的有效推进，目前国内本地感染病例大幅下降，但由于国际交往及劳务输出人员的日益增加，由此带来的输入性疟疾病例却有逐年增加的态势[1]。2015年全国输入性疟疾病例数为3 248例，较2014年(3 021例)增加了7.5%，其中，山东省212例，全部为输入性病例，较2014年(150例)增加了41.3%[2]。

山东省输入性病例主要为恶性疟，间日疟次之，偶见卵形疟和三日疟[3]。根据全国疟疾消除计划，每个疟疾病例必须通过省级镜检复核、聚合酶链式反应(PCR)符合。巢式PCR系统由Snounou在1993年(NP-1993)开发并在各省疟疾诊断参比实验室中推广[4]。2012-2013年，辽宁、海南、贵州、河南、上海和浙江等省(市)先后出现自非洲输入的若干特殊疟疾病例，其镜检结果为卵形疟原虫，但疟疾快速检测试剂盒(RDT)或NP-1993常规巢式PCR检测结果却呈阴性，部分样本被送至国家疟疾诊断参比实验室进行复核鉴定，结果显示这些病例感染的是卵形疟原虫wallikeri亚种(P.ovalewallikeri)，而非curtisi亚种(P.ovalecurtisi)，而NP-1993 检测体系仅对curtisi亚种敏感[5]。

P.ovalecurtisi和P.ovalewallikeri两个亚种最初被命名为CDC-type 和LS-type，是1995年Li等[6]发现的，这两种卵形疟原虫SSU rRNA的序列同源性仅为91.5%。随后，陆续有研究发现，P.ovalecurtisi和P.ovalewallikeri在动合子表面蛋白基因、细胞色素B基因、丝氨酸蛋白基因、核糖体基因、线粒体基因、核基因、以及蚊体内发育所必需的基因均有差异，因此，最终将经典型P.ovale定义为curtisi，将变异型P.ovale定义为wallikeri[7-9]。现将山东省14例输入性P.ovalewallikeri亚种实验室鉴定分析结果报告如下。

1 材料与方法

1.1样本来源 14例样本均为山东基层疾病预防控制中心(CDC)或医疗机构上报的疟疾病例抗凝全血。阴性对照血样为本单位职工健康体检者的抗凝全血。采集血样和进行流行病学调查的所有病例均获得患者本人及家属的知情同意。

1.2主要试剂 QIAamp DNA Mini Kit(德国Qiagen公司)；2×Taq PCR StarMix(北京GenStar公司)；DNA marker(日本Takara公司)。

1.3血涂片厚薄血膜镜检 采集患者抗凝全血或末梢血制作带有厚薄血膜的标准血涂片，干燥，固定后行吉氏染色，油镜下镜检疟原虫。

1.4RDT检测 参照说明书对14例患者血样进行RDT检测。取5 μL全血，垂直加入检测卡上加样孔A内，然后在样品孔B上垂直滴加4滴裂解液，15 min内判读结果。

1.5疟原虫DNA的提取 按照QIAamp DNA Mini Kit说明书提取疟原虫基因组DNA，-20 ℃保存备用。

1.6NP-1993常规巢式PCR扩增 以提取的疟原虫DNA为模板，进行常规巢式PCR扩增[3-4]。首先，使用疟原虫属特异性引物rPLU5/rPLU6进行第1轮扩增；然后以第1轮产物为模板，分别使用rFAL1/rFAL2(恶性疟原虫)、rVIV1/rVIV2(间日疟原虫)、rMAL1/rMAL2(三日疟原虫)和rOVA1/rOVA2(卵形疟原虫)进行第2轮扩增，产物预期大小应分别为205 bp、120 bp、144 bp、800 bp。

1.7p.ovalewallikeri亚种的PCR检测 以提取的疟原虫DNA为模板，引物rPLU1：5′-CCCTACTACTTGATGGTCCTCA-3′和rPLU5：5′-TCAAAGATTAAGCCATGCAAGTGA-3′进行第一轮扩增，以第一轮产物为模板，分别以rOVA1WC：5′-TGTAGTATTCAAACGCAGT-3′和rOVA2WC：5′-TATGTACTTGTTAAGCCTTT-3′，预期产物应为660 bp，此轮扩增可同时检测P.ovalecurtisi和P.ovalewallikeri两个亚种；以rOVA1v：5′-ATCTCCTTTACTTTTTGTACTGGAGA-3′和rOVA2v：5′-GGAAAAGGACACTATAATGTATCCTAATA-3′为引物，预期产物应为780 bp，此轮扩增检测卵形疟原虫P.ovalewallikeri亚种。PCR反应体系：2×PCR Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL，剩余用ddH2O补足至25 μL。

2 结 果

2.1血涂片厚薄血膜镜检结果 14例山东省网报卵形疟病例经基层疾控中心或医疗机构镜检的初检结果：11例卵形疟，3例间日疟；山东省疟疾诊断参比实验室镜检的复检结果：13例卵形疟，1例间日疟。

大多数病例显微镜下卵形疟原虫形态较典型，少数在国外多次不规范用药病例的疟原虫形态不典型，不易与三日疟和间日疟原虫相区别。油镜下可见薄血膜中感染原虫的红细胞变形明显，未胀大或略胀大，呈椭圆形、带毛刺、伞矢状、拖尾、水滴状等多种不规则形状，红细胞边缘多呈锯齿状、凹凸不齐；厚薄血膜中环状体、大滋养体、裂殖体(成熟、未成熟)及配子体(雌、雄)等多期卵形疟原虫均有所见，大滋养体、裂殖体居多，晚期环状体比早期典型环状体偏多，配子体较少。14例患者薄血膜中的环状体含1个红色核，胞浆较粗厚；大滋养体多含1个较粗大红色核(多个病例见到2个核的情况)，不规则阿米巴样蓝色胞浆，空泡多明显、常见较大黄棕色疟色素颗粒；裂殖体略大于正常红细胞，多含6～10个裂殖子，多数与聚集中间的疟色素块一起，形似“菊花状”；配子体典型，较大，多含散在、粗大棕黄色疟色素，核周淡染带明显。裂殖体、配子体含疟色素相对较多。厚血膜原虫数量较多，形态较典型，但与三日疟和间日疟原虫很难鉴别，见图1。

a、b：环状体；c、d：晚期环状体；e、f：大滋养体；g、h：未成熟裂殖体；i、j：裂殖体；k、l：雌配子体；m-p：大滋养体、未成熟裂殖体、裂殖体；a-l薄血膜；m-p厚血膜图1 部分P.ovale wallikeri亚种卵形疟原虫的镜下形态Fig.1 Microscopic structure characteristics of P.ovale wallikeri

2.2RDT结果 14份血样利用疟疾快速诊断试纸条进行检测，其中，12例血样为质控和T2出现反应线，提示为间日疟、卵形疟、三日疟单一感染或混合感染；2例血样仅出现质控反应线，结果为阴性。

2.2NP-1993常规巢式PCR结果 利用NP-1993常规巢式PCR对14份血样进行恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫的检测，PCR结果均为阴性，部分结果见图2。

2.3P.ovalewallikerii亚种的PCR检测结果 采用改进引物进行P.ovalewallikeri亚种的PCR检测，14份血样在第二轮PCR扩增中，分别得到660 bp和780 bp的条带，而P.ovalecurtisi仅得到660 bp的条带，与预期结果一致，见图3。测序后经Blast比对，14份血样均为P.ovalewallikeri亚种感染。

M: DNA标志物；1：P.ovale curtisi阳性对照；2-5：5例样本分别用NP-1993体系中的卵形疟原虫引物、恶性疟原虫引物、三日疟原虫引物和间日疟原虫引物检测结果；6：阴性对照图2 部分疟疾病例NP-1993常规巢式PCR扩增结果Fig.2 PCR product of partial cases by NP-1993 conventional nested PCR

3 讨 论

自2012年山东省首次发现输入性卵形疟病例以来，随着劳务输出的人数增加，输入性卵形疟病例有上升趋势[3]。本研究中的14例卵形疟原虫wallikeri亚种感染患者，均有外出务工或者旅游的境外居留史，且前往的国家(莫桑比克、科特迪瓦、喀麦隆、赤道几内亚、刚果、安哥拉)均为疟疾重度流行区(非洲)。

疟原虫的虫种鉴定是疟疾控制或消除的关键步骤之一，对进一步的规范化治疗和精准防控至关重要。疟疾诊断主要有血涂片显微镜检，RDT和PCR三种常规方法。血液中原虫密度低、混合感染、患者多次不规范服药等均可造成疟原虫形态发生变化，无疑会增加镜检鉴别虫种的难度，从而造成误诊和漏诊[10]。同时，由于卵形疟原虫在形态上和三日疟原虫、间日疟原虫相似，镜检时容易误判。本研究14例卵形疟原虫wallikeri亚种病例中，基层初检时3例误诊为间日疟原虫，因此，仅通过镜检进行疟原虫分类在方法学上不够严谨。

RDT法的优点是简便直观，由于缺少除恶性疟原虫以外的针对其他疟原虫的单一特异RDT检测试剂，因此，RDT检测仅能区分恶性疟原虫感染和非恶性疟的泛疟原虫感染[10]。同时，由于RDT受检测试剂敏感性的限制，也曾出现误诊阴性的病例。本研究中，就出现了2例RDT阴性误诊。

NP-1993常规巢式PCR的发明，极大弥补了RDT法不能有效区分四种疟原虫的缺憾。随着疟原虫基因变异的发生发展，NP-1993体系已经不能满足区分卵形疟原虫curtisi和wallikeri两个亚种的需要。因此，用于检测卵形疟原虫wallikeri亚种的引物应运而生。本研究应用的rOVA1WC/rOVA2WC能同时扩增卵形疟原虫curtisi和wallikeri亚种而产生660 bp的阳性条带，而rOVA1v/rOVA2v仅能扩增卵形疟原虫wallikeri亚种产生780 bp的阳性条带，因此，能有效区分卵形疟原虫curtisi和wallikeri亚种。

M: DNA标志物；1-14：1-14例样本；15：P.ovale curtisi对照；16：阴性对照图3 14例P.ovale wallikeri亚种的PCR扩增结果Fig.3 PCR result of P.ovale wallikeri with 14 malaria cases

2010年，中国政府启动了全国疟疾消除计划(NMEP)，旨在到2020年在全国范围内消除疟疾[11]。自2011年山东省出现最后一例疟疾本地感染病例以来，至2017年底，已经连续6年无本地感染病例，而输入性病例的增加以及基因变异类型疟原虫病例的出现，无疑给医疗工作者带来了新的挑战。因此，研发适用于变异型疟原虫的诊断试剂和检测技术，有利于特殊病例的及早发现和精准治疗，是对NMEP有效推进的技术保障。