运输应激对蛋鸡卵巢iNOS活性、NO含量及性激素受体基因表达的影响

姜清漪，吕占军

(东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨 150030)

环境突变或长期处于不适宜的环境，鸡易受应激因素的不良影响。运输应激使鸡遭受多种应激原，包括人为因素(捕捉、限饲等)、环境变化(颠簸、高温、高密度等)及社群压力等[1-3]。研究表明，应激因素会引起一氧化氮(nitric oxide,NO)过量产生损伤血管屏障导致组织水肿，产生的炎症介质进而刺激诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)活性增加[4]。NO和NOS参与卵巢性腺激素的分泌[5]，现已证实过量的NO能够抑制性腺类固醇激素的合成[6]。

近年来，运输应激越来越受到国内外研究人员的关注，但大多研究运输应激对大型家畜或对肉禽肉质及死亡率，以及对蛋禽卵巢功能影响的研究相对较少。本试验主要针对运输应激对蛋鸡卵巢iNOS活性、NO含量及性激素受体mRNA表达的研究，旨在了解运输应激对蛋鸡卵巢组织及产蛋性能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 健康海兰褐蛋鸡40只，32周龄，体重约1.853 kg，哈尔滨益农禽业有限公司提供。

1.1.2 主要试剂 iNOS测定试剂盒、NO测定试剂盒和考马斯亮蓝法蛋白质定量测试盒，购自南京建成生物工程研究所；雌二醇受体(estradiol receptor,E2R)引物、孕酮受体(progesterone receptor,PR)引物、AR引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(引物信息详见表1)；总RNA提取试剂,宝生物工程(大连)有限公司产品；反转录试剂盒，北京金式金生物技术有限公司产品；荧光染料，罗氏诊断产品(上海)有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和试验处理 40只海兰褐蛋鸡随机分为对照组和试验组，每组20只。试验鸡均饲喂于同一鸡舍，饲养管理条件相同(白天为自然光照，晚上辅以人工光照)，自由采食和饮水，适应期为1周。运输途中停止饲喂食物和水。试验组采用家禽运输车在公路(包括红绿灯路口和颠簸路段)上以60 km/h的车速进行6 h的道路运输。返回鸡舍后，从对照组和试验组随机选取6只鸡处死，分别采集两组鸡卵巢组织冻存于-80℃冰箱中，之后进行iNOS活性、NO含量及性激素受体mRNA表达的测定。

1.2.2 样品采集和指标检测 从-80℃冰箱中取0.5 g卵巢组织，加9倍的生理盐水制备成10%的组织匀浆，低温离心(3 000 r/min，10 min)后，取50 μL上清液参照各检测试剂盒说明书采用分光光度法测定iNOS活性和NO含量；按照详细的试验步骤，从-80℃冰箱中取0.1 g组织进行RNA的提纯、反转录及荧光定量PCR反应，结果用2-△△CT法表示各激素受体mRNA表达量。

1.2.3 数据统计分析 用GraphPad Prism 5.0作图软件进行绘图，试验数据用SPSS 19.0统计学软件进行处理，检验结果用平均值±标准差表示，组间差异比较采用One-Way ANOVA分析，两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异显著，P<0.01、P<0.001为差异极显著。

表1 E2R、PR、AR和β-actin基因引物信息

2 结果

2.1 运输应激对蛋鸡卵巢iNOS活性和NO含量的影响

运输应激对蛋鸡卵巢iNOS活性和NO含量的影响见表2、图1和图2。由图1可知，运输应激6 h后，与对照组相比，试验组的iNOS活性极显著增加(P<0.01)。由图2可知，运输应激6 h后，与对照组相比，试验组的NO含量极显著升高(P<0.01)。

表2 卵巢蛋白浓度、iNOS活性和NO含量

**表示差异极显著(P<0.001)

** shows extremely significant difference (P<0.001)

图1卵巢iNOS活性

Fig.1 iNOS activity in ovaries

通过以上结果可以说明，运输应激可以使蛋鸡卵巢iNOS活性增加，NO含量升高。

**表示差异极显著(P<0.001)

** shows extremely significant difference (P<0.001)

图2卵巢NO含量

Fig.2 NO content in ovaries

2.2 运输应激对蛋鸡卵巢性激素受体基因表达的影响

运输应激对蛋鸡卵巢性激素受体mRNA表达的影响见表3和图3。运输应激6 h后，与对照组相比，试验组E2R mRNA相对表达量极显著降低(P<0.001)，试验组PR mRNA相对表达量极显著降低(P<0.001)，试验组AR mRNA相对表达量极显著升高(P<0.001)。

通过以上结果可以说明，运输应激可以使蛋鸡卵巢E2R、PR mRNA相对表达量降低；使AR mRNA相对表达量升高。

表3 卵巢E2R、PR和AR mRNA相对表达量

***表示差异极显著(P<0.001)

*** shows extremely significant difference (P<0.001)

图3卵巢性激素受体mRNA相对表达量

Fig.3 Relative mRNA expression of ovarian gonadal
hormone receptors

3 讨论

有报道表明，发生应激反应时鸡群慌恐欲逃，惊慌过度的鸡高声鸣叫，严重时表现精神呆滞甚至死亡[7-8]。本试验在对蛋鸡进行运输应激后，观察到警觉，躁动不安，鸣叫，羽毛杂乱竖立，张口呼吸且频率加快等表现。对应激组的鸡进行剖检，观察到除心肌轻微充血外，其他脏器无明显特征性病变。这些表现与上面的报道存在相似性，同时也与胡丹等[9]、杨正等[10]观察结果基本一致。

强烈持久的应激作用导致的全身或局部炎症反应，可作为宿主防御和机体器官功能障碍的重要指标[11]。NO由左旋精氨酸在NOS催化下合成，与机体的许多生理或病理过程密切相关。NOS包括神经元型一氧化氮合酶(nNOS或bNOS)，内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和iNOS，其中只有iNOS能够催化产生大量NO且这个过程仅在炎症反应中表达[12-13]。NO通过下丘脑促性腺激素释放激素直接作用于卵巢脉管系统调控生殖活动[14]。大量研究表明，正常生理状态下，适量NO和NOS可作为促生长剂对雌性动物卵泡发育、卵巢类固醇激素合成等是必要且有利的，当外界应激因素影响机体出现非稳态时NO则会大量迅速合成，有研究者认为过量NO对性腺类固醇合成有消极作用[15-19]。但是NO对于卵巢雌激素和孕酮分泌的抑制机制尚未完全清楚，一般认为，NO对雌二醇的抑制效应可能是因为NO抑制了与雌二醇生成有关的细胞色素P450芳香化酶活性，继而使用来合成雌二醇前体的雄烯二酮作用受到抑制，致使雄烯二酮，尤其是睾酮堆积过量[6]。

本试验表明，运输应激组蛋鸡卵巢iNOS活性增加、NO含量升高，E2R和PR 相对mRNA表达量降低、AR mRNA相对表达量升高，这说明运输应激可能引起卵巢组织发生炎症反应，引起卵巢组织损伤，产生过量NO，抑制与卵泡发育、排卵等生殖活动相关的雌二醇和孕酮的合成，而AR mRNA相对表达量的升高预示着卵巢可能发生疾病。NO/iNOS与性激素关系以及性激素间调控的具体机制还有待进一步深入研究。