UPLC-Q-TOF-MS法测定绵羊血浆中阿苯达唑及其3种代谢产物的浓度及药代动力学研究

张海波， 黄 琼， 卢 帅， 李志强， 陈 蓓， 赵 军

(新疆医科大学1第一附属医院药学部， 乌鲁木齐 830054； 2药学院， 乌鲁木齐 830011；3新疆埃乐欣药业有限公司， 乌鲁木齐 830013; 4新疆医科大学动物实验中心， 乌鲁木齐 830011)

阿苯达唑(albendazole，ABZ)因其治疗包虫感染疗效良好、毒性作用小及其药物经济学方面的优势，已成为包虫病药物治疗的首选，成为 WHO 推荐的抗包虫病的一线药物，也是目前公认的抗细粒棘球蚴有效药物[1]。ABZ 给药吸收后在肝脏/肠内迅速代谢为阿苯达唑亚砜(albendazole sulphoxide，ABZSO)，ABZSO 进而转化成阿苯达唑砜(albendazole sulphone，ABZSO2)，最终代谢为阿苯达唑-氨基砜(albendazole amino sulphone，ABZSO2-NH2)，其中，ABZSO是主要的代谢产物和抗包虫的活性成分[2]。阿苯达唑脂质体混悬液是由新疆医科大学第一附属医院温浩等研制的阿苯达唑新剂型，现已成功转化为医院制剂，用于临床包虫病的治疗。课题组前期研究表明，大鼠或小鼠给药阿苯达唑脂质体混悬液后血中 ABZSO和ABZSO2浓度及其生物利用度均有所提高，药物在体内的存留时间延长，体内分布速度加快，并具有一定的肝靶向性[3-5]。生物样品中 ABZ 及其代谢物的检测多以ABZSO和ABZSO2为指标成分，检测方法以 HPLC-UV[6]最为常用。因液相色谱-质谱联用法具有准确度高、可靠性强、灵敏度高、选择性强、分析快速且成本低等优点，在生物样本分析中得到了广泛的应用[7]。本研究建立了同时测定绵羊血浆中ABZ、ABZSO、ABZSO2及ABZSO2-NH2浓度的超高效液相色谱-飞行时间质谱联用(UPLC-Q-TOF-MS)分析方法，并应用该方法测定绵羊灌胃给予阿苯达唑脂质体混悬液后经时血药浓度，计算其主要药代动力学参数，为进一步研究阿苯达唑脂质体混悬液在体内的吸收和代谢提供参考，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1仪器BP211D型分析天平(德国Sartorius公司)，Acquity UPLC I-Class型超高效液相色谱仪(美国Waters公司)，Xevo G2-S QTof型质谱检测器(美国Waters公司)，MassLynx V4.1版本工作站(美国Waters公司)，FJY1002-4VF基因研究型超纯水机(青岛富勒姆科技有限公司)，LG10-2.4A型高速冷冻离心机(中科中佳科学仪器有限公司)，MS 3 basic型涡旋振荡器(德国IKA公司)，DZKW型4孔电子恒温水浴锅(北京永兴明医疗仪器厂)，KQ-200VDB型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试药阿苯达唑(ABZ，美国Sigma公司，批号：081M1540V，纯度>98%)，阿苯达唑亚砜(ABZSO，加拿大TRC公司，批号：5-ABY-166-1，纯度>98%)，阿苯达唑砜(ABZSO2，加拿大TRC公司，批号：SZBB229XV，纯度>98%),阿苯达唑氨基砜(ABZSO2-NH2，美国SCBT公司，批号：sc-207278，纯度≥98%)，内标物甲苯咪唑(mebendazole，MBZ，加拿大TRC公司，批号：4-XYZ-40-1，纯度>98%)，甲醇(美国Fisher公司，批号：143714)，乙腈(美国Fisher公司，批号：155753)，甲酸(天津市光复精细化工研究所，批号：20140629)，去离子水(FJY1002-4VF基因研究型超纯水机制水)，阿苯达唑脂质体混悬液(ABZ 含量10.0 mg/mL，批号：20130822，新疆医科大学第一附属医院)。

1.3实验动物6只健康绵羊，雌性，体质量(23.0±2.2)kg，饲养于新疆医科大学动物实验中心，生产许可证号SCXK (新) 2011-0004。

2 方法与结果

2.1色谱与质谱条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC○RBEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流动相：甲醇(A)-水(0.1% 甲酸，B)，梯度洗脱条件[ 0～3.5 min (10%～55% B)，3.5～3.8 min (55%～90% B)，3.8～4.4 min (90% B)，4.4～6 min (90%～10% B)]，流速：0.4 mL/min，柱温：40℃，进样器温度：10℃，进样量：2 μL。

2.1.2 质谱条件 正离子模式，离子源参数：毛细管电压 0.5 kV，离子源温度100℃，脱溶剂温度 450℃，锥孔电压 40 V，提取锥孔电压80 V，锥孔气流量50 L/h，脱溶剂气流量(N2)800 L/h。选择监测离子检测( SIM)：ABZ m/z 266.096，ABZSO m/z 282.091，ABZSO2m/z 298.086，ABZSO2-NH2m/z 240.081，内标MBZ m/z 296.104 (均为质子化的母离子[M+H]+)，见图1-5。

图1 ABZ 化学结构及母离子[M+H]+质谱图

2.2溶液的配制方法

2.2.1 对照品溶液的配制 称取ABZ、ABZSO、ABZSO2、ABZSO2-NH2和MBZ标准品适量，甲醇溶解，配制成浓度为100 μg/mL的储备液，用甲醇稀释得8个浓度混合对照品溶液和固定浓度内标溶液，用于制备各浓度的校正标样和质控样品，置于4℃冰箱保存备用。

图2 ABZSO 化学结构及母离子[M+H]+质谱图

图3 ABZSO2 化学结构及母离子[M+H]+质谱图

图4 ABZSO2-NH2 化学结构及母离子[M+H]+质谱图

图5 MBZ 化学结构及母离子[M+H]+质谱图

2.2.2 标准血浆样品和质控血浆样品的的配制 分别取“2.2.1”项下8个浓度混合对照品溶液20 μL，氮气吹干，加入空白绵羊血浆200 μL复溶，涡旋混匀，制得8个浓度标准血浆样品，ABZ、ABZSO、ABZSO2、ABZSO2-NH2在血浆中的有效质量浓度范围分别为6.2～798.0、5.2～5 370.0、3.3～3 168.0、8.6～1 100.0 ng/mL。同法制备3个浓度水平质控(quality control, QC)样品，低浓度质控(low QC, LQC)样品ABZ、ABZSO、ABZSO2、ABZSO2-NH2浓度分别为18.6、15.6、9.9、25.8 ng/mL，中浓度质控(middle QC, MQC)样品分别为319.2、2 148.0、1 267.2、440.0 ng/mL， 高浓度质控(high QC, HQC)样品浓度分别为638.4、4 296.0、2 534.4、880.0 ng/mL。

2.3动物的给药和血样采集方法6只健康绵羊，单剂量灌胃给予阿苯达唑脂质体混悬液，给药剂量为10 mg/kg。给药前禁食不禁水 12 h，于给药前和给药后 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、24.0、36.0、48.0、60.0 和 72.0 h 颈静脉采血，每次取血 5 mL于肝素管中，3 000 r/min 离心 10 min，分离上层血浆，-80℃储存待测。

2.4血浆样品的处理取20 μL内标溶液(357.7 ng/mL)，氮气吹干，加入血浆样品200 μL，涡旋混匀2 min，超声处理10 min，加入乙腈800 μL，涡旋混匀2 min，4℃ 12 000 r/min 离心20 min，取上清液2 μL按“2.1”项下色谱与质谱条件分析。

2.5专属性按“2.1”项下色谱与质谱条件分析，ABZ、ABZSO、ABZSO2、ABZSO2-NH2和内标MBZ保留时间分别为3.81、2.42、2.64、1.27和3.71 min左右，无内源性物质干扰待测组分和内标的测定，具有良好的专属性。绵羊空白血浆添加ABZ、ABZSO、ABZSO2、ABZSO2-NH2和内标MBZ的标准血浆样品，口服阿苯达唑脂质体混悬液后血浆样品的典型色谱图，见图6-7。

图6 空白绵羊血浆添加对照品典型色谱图

2.6回归方程的建立取“2.2.2”项下 8 个浓度标准血浆样品，按“2.4”项下方法操作，以ABZ、ABZSO、ABZSO2、ABZSO2-NH2的标准浓度(C)为横坐标，ABZ、ABZSO、ABZSO2、ABZSO2-NH2与内标的峰面积比值(Y)为纵坐标，采用最小二乘法进行线性拟合，得线性回归方程及定量范围，见表1。

图7 绵羊口服阿苯达唑脂质体混悬液后血浆样品典型色谱图

名称回归方程r定量范围/(ng/mL)ABZY=0.031 8 C+0.588 60.999 56.2～798.0ABZSOY=0.010 9 C+0.834 00.998 15.2～5 370.0ABZSO2Y=0.017 4 C+0.042 00.999 43.3～3 168.0ABZSO2-NH2Y=0.002 8 C+0.220 70.998 88.6～1 100.0

2.7精密度和准确度实验取 3 个浓度水平的QC样品，每个浓度平行测定5份，按“2.4”项下方法操作，连续测定3 d。采用随行标准曲线计算QC样品测定浓度，根据测定值与实际值进行计算，考察方法的精密度与准确度。结果显示，本法ABZ及其3种代谢产物3个质控浓度血浆样品分析的日内、日间精密度RSD均<15%，准确度偏差均<15%，表明该方法精密度和准确性较好。

2.8回收率和基质效应实验取3个浓度水平的QC样品，每个浓度平行测定5份，按“2.4”项下方法操作，测定阿苯达唑及其3种代谢产物峰面积为A；另取空白血浆样品，加入乙腈(体积比1∶4)，涡旋混匀2 min，4℃ 12 000 r/min，离心20 min，取上清液得空白血浆提取液，按“2.2.1”项下方法处理，制成3 个浓度水平的对照品溶液，每个浓度平行测定5份，测定其峰面积为B；用水-乙腈(体积比1∶4)制成 3 个浓度水平的对照品溶液，每个浓度平行测定5份，测定其峰面积为C，按A/B×100% 计算提取回收率，按B/C×100% 计算基质效应，结果显示ABZ及其3种代谢产物3个质控浓度提取回收率范围为95.3%～107.4%，RSD<14.4%；基质效应范围为95.7%～108.7%，RSD<12.0%；MBZ 提取回收率为103.2%，RSD=7.3%；基质效应为98.5%，RSD=12.3%，表明该方法提取回收率较高,精密度良好,且无基质效应。

2.9稀释可靠性考察取80 μL制备定量上限(ULOQ)标准血浆样品的对照品溶液，氮气吹干，加入空白血浆200 μL复溶，涡旋混匀，制得浓度4倍于ULOQ的标准血浆样品，平行制备5份样品，取100 μL，每份添加400 μL空白绵羊血浆稀释5倍，按“2.4”项下方法操作，采用随行标准曲线计算稀释样品测定浓度，根据测定值与实际值进行计算，考察精密度与准确度。结果显示准确度和精密度在±8%之内，表明样品稀释不影响准确度和精密度，因此浓度高于ULOQ的血浆样品可以用空白血浆充分稀释后重新分析。

2.10残留效应考察进样分析ULOQ标准血浆样品后，进样分析空白血浆样品，根据峰面积比值进行计算，考察残留效应。ABZ及其3种代谢产物残留均小于10%，内标的残留小于1%，表明该实验的残留效应是可以忽略不计的。

2.11稳定性实验

2.11.1 储备液稳定性 将“2.2.1”项下储备液在室温(25℃)放置3 h及冷藏条件下(2～8℃)放置15 d的稳定性，通过稀释储备液，进样，计算ABZ、ABZSO、ABZSO2、ABZSO2-NH2与内标的峰面积比值，并同新鲜配制的储备液同法得到的比值相比较，范围为87.7 %～105.4%，RSD<9.6%，表明储备液在上述条件下稳定。

2.11.2 质控样品冻融稳定性 配制3个浓度水平的QC样品，-80℃冷冻冰箱储存备用，取3个浓度水平QC样品，每个浓度平行测定5份，室温融化，当完全解冻时，样品在-80℃条件下再冷冻24 h，重复两次冻融循环，在第3个循环按“2.4”项下方法操作，采用随行标准曲线计算QC样品测定浓度，根据测定值与实际值进行计算，考察两者间的偏差，结果显示偏差在10%以内，RSD<12.31%，表明样品的冻融稳定性良好。

2.11.3 质控样品短期稳定性 取3个浓度水平的QC样品，每个浓度平行测定5份，于室温放置4 h，按“2.4”项下方法操作，采用随行标准曲线计算QC样品测定浓度，根据测定值与实际值进行计算，考察两者间的偏差，结果显示偏差在15%以内，RSD<14.26%，表明血浆样品在处理过程中，室温放置4 h稳定性良好。

2.11.4 质控样品长期稳定性 取3个浓度水平的QC样品，每个浓度平行测定5份，于-80℃冷冻冰箱储存2个月，按“2.4”项下方法操作，采用随行标准曲线计算QC样品测定浓度，根据测定值与实际值进行计算，考察两者间的偏差，结果显示偏差在15%以内，RSD<12.14%，表明血浆样品在-80℃冷冻冰箱储存1个月稳定性良好。

2.11.5 处理后样品稳定性 取3个浓度水平的QC样品，每个浓度平行测定5份，按“2.4”项下方法操作，置自动进样器(10℃，24 h)进样测定，采用随行标准曲线计算QC样品测定浓度，根据测定值与实际值进行计算，考察两者间的偏差，结果显示偏差在15%以内，RSD<12.37%，表明血浆样品处理后在自动进样器(10℃)24 h内稳定性良好。

2.12药代动力学参数的测定取“2.3”项下所采集的血浆样品，按“2.4”项下处理方法进行前处理，经UPLC-Q-TOF-MS法测定各时间点的血浆药物浓度，并绘制药时曲线，见图8，将血药浓度-时间数据采用Kinetica 5.1程序进行非房室模型分析，计算药代动力学参数，见表2。

表2 ABZSO和ABZSO2在绵羊体内的主要药动学参数

注：Cmax：达峰浓度；Tmax：达峰时间；AUC：血药浓度-时间曲线下面积；T1/2：消除半衰期；MRT：平均滞留时间；CL：清除率；Vz：表观分布容积。

图8 绵羊灌胃给予阿苯达唑脂质体混悬液后ABZSO和ABZSO2的药时曲线

3 讨论

本研究建立了 UPLC-Q-TOF-MS法测定阿苯达唑及其 3 种代谢产物(阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜、阿苯达唑氨基砜)血药浓度的方法，参考相关生物分析方法验证指导原则[7-8]对建立的方法进行系统的验证，结果表明方法灵敏度较高，满足血药浓度测定要求。采用乙腈直接沉淀蛋白处理血浆样品，具有前处理简单，成本较低等优点。绵羊口服阿苯达唑脂质体混悬液后在血浆中均不能检测到ABZ，这可能与肝脏的首过效应有关；给药后36、48 h后能检测到较低浓度ABZSO2-NH2，结果与相关文献报道一致[9-11]，故本研究未对ABZ及ABZSO2-NH2进行完整的药代动力学分析。血浆中ABZSO浓度高于ABZSO2，ABZSO是ABZ在绵羊体内的主要代谢产物和抗包虫的活性成分。本研究为阿苯达唑脂质体混悬液的临床应用提供有价值的参考，也将为该制剂的进一步开发利用提供理论依据。