携白细胞介素-8单克隆抗体靶向造影剂对兔急性心肌梗死模型的超声评估

陈建福，张容亮，孙 月，陆永萍

(云南省第二人民医院超声科，昆明 650021)

冠心病(coronary heart disease，CHD)亦称缺血性心脏病，是当今危害人类健康和生命最主要的疾病之一，其中以急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)的影响最大[1]，全世界每年至少有1 700万人死于AMI及其并发症，位列死亡原因之首。如何快速、准确地诊断出AMI及确定梗死区域是目前研究的重点。研究表明，白细胞介素-8(IL-8)是参与心肌梗死重要的炎性因子[2]，也是一种趋化因子。本实验拟开胸结扎兔左冠状动脉前降支(left anterior descending，LAD)建立兔AMI模型，应用临床上常用的SonoVue造影剂偶联IL-8单克隆抗体(简称“IL-8单抗”)制备靶向超声造影剂[3]，对实验动物行心肌声学造影(MCE)检查，并根据显影情况，第一时间进行视觉评估，从而快速、精确地判断梗死区域，为临床进一步研究AMI奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康成年日本大耳兔32只，体质量(3.0±0.5)kg，随机分为两组：AMI模型组和假手术(Sham)对照组，每组16只。

1.1.2 实验仪器 Philips iE33超声诊断仪，S5-1探头，频率1.8/3.6 MHz。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立 AMI组：3%戊巴比妥钠注射液(1 mL/kg)经兔耳缘静脉缓慢注射麻醉后，消毒、铺巾，于兔胸骨左缘3、4肋骨水平作长3～4 cm的纵形切口,依次切开皮肤、皮下组织，分离肌肉层，充分暴露心包，剪开心包暴露心脏的手术视野，用5-0 Prolene带针缝线连同心大静脉一起结扎左冠状动脉。肉眼观察结扎远端局部心肌颜色出现暗红色，再变成暗紫色且搏动减弱，动态监测兔心电图波形出现ST段上抬、压低或病理性Q波，初步判断模型成功建立[4]。Sham组：同一结扎点只穿线不结扎。AMI组和Sham组兔均行四肢电极连接MEDLAB-4C501H型生物信号采集处理系统，行心电监护。

1.2.2 靶向造影剂的制备

1.2.2.1 造影剂制备 采用共价偶联法通过异型双功能交联剂(SPDP)将IL-8单抗偶联于SonoVue微泡表面，获得携IL-8单抗的微泡悬液[5]，制备靶向超声造影剂。

1.2.2.2 微泡悬液的鉴定 (1)玻片凝集实验鉴定：携IL-8单抗的偶联造影剂微泡悬液与羊抗鼠IgG血清混合，倒置显微镜下可观察到凝集反应[6]；单纯SonoVue造影剂微泡悬液与羊抗鼠IgG血清混合液倒置显微镜下未观察到凝集反应。(2)荧光染色实验鉴定：携IL-8单抗的偶联造影剂微泡悬液表面可见荧光，单纯SonoVue造影剂微泡未见荧光。

1.3 超声心动图及MCE检查 各实验兔分别于术前，术后30 min、2 h、6 h行常规心脏超声检查，先行SonoVue造影剂MCE检查，间隔10 min，行携IL-8单抗靶向造影剂MCE检查。两种造影剂(SonoVue造影剂、IL-8单抗+SonoVue偶联造影剂)使用前摇匀，每次均抽取0.2 mL微泡悬液(约0.05 mL/kg)，经兔耳缘静脉10 s内匀速推注完，并用2 mL生理盐水冲注。取左室短轴乳头肌水平切面观察心肌各节段显影，检查过程中的动静态图像全部存储用于视觉分析评估。全分析过程采用盲法，实验动物只用编号，不标明分组。

1.4 心肌造影剂充盈视觉评估 +++：心肌造影剂显影明显，视频强度明显增强，接近左心腔内造影剂强度；++：心肌造影剂显影一般，视频强度低于左心腔内造影剂强度；+：心肌造影剂显影暗淡，视频强度明显低于左心腔内造影剂强度；-：心肌不显影。

2 结 果

2.1 模型建立情况 Sham组3只死亡，其中1只开胸后即死，可能与麻醉剂量不当有关，另2只于术中胸膜破裂死亡。AMI组4只死亡，其中2只于冠状动脉结扎约1、3 h后死亡，可能与麻醉剂量不当、AMI面积过大等有关，另2只于术中胸膜破裂死亡。最后纳入实验分析的模型有25只，Sham组13只，AMI组12只。

2.2 视觉评估

2.2.1 SonoVue造影剂心肌造影视觉评估 AMI组的造影剂显影程度明显低于Sham组，见图1。

橙色箭头所示：AMI组造模节段前壁心肌显影的充盈缺损区

图1 Sham组和AMI组术后6 h心肌声学造影图

2.2.2 携IL-8单抗的靶向造影剂行心肌造影视觉评估 携IL-8单抗靶向造影剂行MCE检查，AMI组各节段心肌造影剂充盈情况的视觉评估术前各节段造影剂充盈均一致，视频强度整体偏低(与偶联造影剂的微泡密度相对偏低有关)；AMI组术后30 min，两造模节段前壁、前间隔充盈初期即可见造影剂充盈，中期即达峰值，中期至峰值期表现为平台；全部充盈过程，视频强度均强于术前，前间隔与前壁强于后间隔与下壁。术后2、6 h视觉评估与术后30 min相似，见表1。AMI组携IL-8单抗靶向造影剂及SonoVue造影剂行MCE检查造影剂显影情况比较，术前两种造影剂造模节段呈相似均匀一致充填；术后30 min，两个造模节段携IL-8单抗靶向造影剂显影视频强度均强于SonoVue造影剂；术后2、6 h视觉评估与术后30 min相似，见表2。术后30 min，Sham组心肌前壁未见明显造影剂充盈，AMI组可见造影剂充盈；术后2、6 h视觉评估与术后30 min相似，见图2。术后30 min，Sham组心肌前间隔未见明显造影剂充盈，AMI组可见造影剂充盈。术后2、6 h视觉评估与术后30 min相似，见图3。

表1 AMI组各节段心肌造影剂充盈情况的视觉评估

黄色虚线区：造模节段前壁心肌充盈初期

图2 Sham组和AMI组携IL-8单抗靶向造影剂

黄色虚线区：造模节段前间隔心肌充盈初期

图3 Sham组和AMI组携IL-8单抗靶向造影剂心肌前间隔术后声学造影图

3 讨 论

AMI是由于冠状动脉急性闭塞而导致部分心肌缺血性坏死的过程，常发生在冠状动脉粥样硬化病变的基础上[7]。心肌缺血、梗死部位常释放出多种炎性因子。研究证明，AMI后会出现血清IL-8水平升高,IL-8是参与心肌梗死的重要炎性因子[8-9]。本研究通过将IL-8单抗连接到声学造影剂表面构筑成靶向声学造影剂，使造影剂快速、主动结合到靶区，从而进行特异性的超声分子成像，以期准确、及时地判断局部室壁运动异常区域内有无存活心肌，为临床选择治疗措施、疗效预测和预后评估提供重要的依据[10]。

传统二维超声心动图可以显示出心室壁各部分的运动，检出心肌梗死所致的室壁运动异常[11],但是无法在第一时间精确地诊断出心肌梗死的具体区域。行心肌超声造影检查时，某一区域心肌的视频密度代表了该区域即时造影剂的浓度,因此可用MCE检查判断心肌血供情况[12]。当心肌微循环尚未受损时，心肌内可见声学造影剂均匀充盈；当心肌梗死时，由于血供不足或中断，局部节段心肌出现造影剂灌注缺损，显影视频强度明显减弱[13]。

本实验研究发现，同一实验兔，单用SonoVue造影剂行MCE检查时，AMI组造模节段的心肌显影视频强度均低于术前，均低于Sham组；AMI组造模节段的心肌显影视频强度均低于非造模节段。而用携IL-8单克隆抗体的靶向造影剂行MCE检查时，AMI组造模节段的心肌显影视频强度均高于术前，均高于Sham组；AMI组造模节段的心肌显影视频强度均高于非造模节段。在造影剂单因素不同，其他实验因素都相同的情况下，可说明IL-8单克隆抗体与缺血心肌释放的炎性因子IL-8之间的补体效应所致的趋化性和靶向作用。

用携IL-8单抗的靶向造影剂行心肌声学造影时，AMI组术后30 min即表现为造模节段造影剂充盈明显强于非造模节段，充盈速度快于非造模节段。但从心肌微循环的角度来看，AMI组术后30 min造模节段的微循环受损并减少[14]，而侧支循环尚未完全建立，MCE本应表现为充盈缺损或充盈程度低于非梗死区，而实际却相反，由此分析得出炎性因子IL-8在AMI早期(术后30 min)增高即很明显。携IL-8单抗的靶向造影剂的MCE检查对于心肌缺血的敏感性和特异性均优于常规超声造影剂，优于传统二维超声心动图，能更早期、更快速、更精准地诊断出缺血性心脏病。

本实验研究在实际操作过程中尚存在某些不足，采用共价偶联法制备的靶向超声造影剂密度偏低，显影强度不够，可能与造影剂制备过程中操作手法不当，相关技巧、工艺尚未完全成熟有关。

综上所述，携IL-8单抗靶向声学造影剂与缺血心肌所释放的炎性因子IL-8之间存在靶向作用，携带IL-8单抗靶向造影剂的MCE检查对缺血心肌诊断更准确，可早期定位诊断，是目前较为理想的检查方法，有着广阔的研究应用前景，靶向性心肌声学造影技术将为人类缺血性心脏病的诊疗开辟一个新途径。