秦皮乙素降低多柔比星诱导心脏毒性的研究*

李 潇，徐 繁，房 亮，曹向宇，姜海军，肖 旭

（承德医学院附属医院，河北承德 067000）

秦皮乙素降低多柔比星诱导心脏毒性的研究*

李 潇，徐 繁△，房 亮，曹向宇，姜海军，肖 旭

（承德医学院附属医院，河北承德 067000）

目的:探讨秦皮乙素（Esc）对多柔比星（DOX）诱导的H9C2细胞损伤的保护作用及机制。方法：培养H9C2心肌细胞并分为对照组、模型（DOX）组和干预（Esc+DOX）组。流式细胞术检测细胞凋亡情况和细胞内活性氧（ROS）的水平；蛋白印迹法检测cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid和Bcl-2蛋白的表达情况。结果：模型组H9C2细胞凋亡数量、ROS水平，cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid蛋白表达明显高于对照组，Bcl-2蛋白表达明显低于对照组（P＜0.05）；干预组H9C2细胞凋亡数量、ROS水平，cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid蛋白表达明显低于模型组，Bcl-2蛋白表达明显高于模型组（P＜0.05）。结论：秦皮乙素可减轻多柔比星所致的心脏毒性，其作用机制与减少细胞凋亡、降低ROS水平有关。

多柔比星；秦皮乙素；心脏毒性

多柔比星（DOX）是一种具有强抗肿瘤作用的蒽环类抗生素，主要用于治疗乳腺癌、淋巴瘤和黑色素瘤等，但可造成严重的不良反应，如不可逆转的心肌病和充血性心力衰竭。因此，多柔比星的临床应用非常有限[1]。多柔比星诱导心脏毒性的机制比较复杂，包括刺激自由基形成增加、线粒体损伤、细胞凋亡等[2]。有研究发现，多柔比星可引起内质网应激、增加活性氧（ROS）的生成，进而导致心肌细胞凋亡[3]。秦皮乙素（Esc）是中药秦皮的主要活性成分，具有止咳、祛痰、平喘的功效，以及抗炎、保肝、抗肿瘤等作用[4]。有研究表明，秦皮乙素可清除氧自由基、保护细胞免受过氧化物造成的损伤[5-6]。因此推测，秦皮乙素是否具有保护多柔比星所致心肌细胞损伤的作用？为此，本研究建立了多柔比星致大鼠胚胎心肌细胞（H9C2细胞）损伤模型，以探讨秦皮乙素保护多柔比星致心肌细胞损伤的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 大鼠胚胎心肌细胞H9C2，来源于中国科学院细胞库。RPMI-1640培养基和胎牛血清（FBS），购于HyClone Laboratories公司（美国）；Lipofectamine RNAiMAX BCA蛋白浓度测定试剂盒、AV-PI检测试剂盒，购于Beyotime生物技术公司（中国南通）；Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP、Bid、Bcl-2、GAPDH一抗（兔来源多抗）、二抗（羊抗兔IgG HRP抗体），购于Proteintech公司(中国武汉)；DCFH-DA，购于Invitrogen公司（美国）；多柔比星、秦皮乙素，购于阿拉丁生物化学技术有限公司（中国上海）。

1.2 细胞培养 H9C2细胞用含有10% FBS的RPMI-1640培养基于37℃、5% CO2培养箱中培养，当细胞覆盖培养瓶底部的80%时，使用胰蛋白酶消化以制备单细胞悬液。然后根据需要将细胞接种到培养板中进行分组实验。

1.3 MTT法检测H9C2细胞的活力 将H9C2细胞接种到96孔板，调整细胞浓度为5×104个/ml，细胞分为三组，对照组、5μM秦皮乙素组和10μM秦皮乙素组，每组设3个复孔。对照组细胞只加培养基，两个秦皮乙素组细胞分别加入5μM、10μM秦皮乙素培养2小时；然后各组细胞加入不同浓度的多柔比星（0μM、1μM、2μM、4μM、8μM、16μM）继续培养48小时。丢弃培养液并用PBS洗涤三次，然后每孔加入浓度为5mg/ml的MTT工作溶液；4小时后，加入100μl二甲基亚枫（DMSO），振荡10分钟。用酶标仪在570nm处检测吸光值（OD），并计算细胞存活率，细胞存活率(%)=（给药组OD/空白组OD）×100%。

1.4 AV-PI双染流式细胞术检测H9C2细胞凋亡 将H9C2细胞接种到6孔板，调整细胞浓度为1×106个/ml。将细胞分成三组，对照组，模型组（DOX）和干预组（Esc+DOX），每组设3个复孔。对照组细胞只加入培养基；模型组细胞加入8μM多柔比星培养48小时；干预组细胞先加入10μM秦皮乙素培养2h，然后加入8μM多柔比星继续培养48小时。培养结束后，用PBS洗涤细胞并用胰蛋白酶进行消化。将收集的细胞重悬于0.3ml结合缓冲液中，加入5μl AV和5μl PI室温下避光孵育15分钟，然后加入0.2ml结合缓冲液，使用流式细胞仪检测每组细胞的凋亡情况。

1.5 流式细胞仪检测H9C2细胞ROS水平 H9C2细胞分组和处置方法同1.4。培养结束后，在细胞中加入10μM DCFH-DA染色溶液，37℃避光孵育20分钟，采用流式细胞仪检测各组细胞ROS的水平。

1.6 蛋白印迹法检测H9C2细胞cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid和Bcl-2蛋白的表达 H9C2细胞分组和处置方法同1.4。培养后收集细胞，RIPA细胞裂解液裂解细胞，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，湿式转膜将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，分别加入cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid、Bcl-2、GAPDH一抗（1：1000）4℃孵育过夜，二抗（1：2000稀释）室温下孵育2h，ECL超敏发光液显影并摄片。以目的条带灰度值与GAPDH条带灰度值的比值作为各目的蛋白的相对表达量。

1.7 统计分析 使用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，所有实验数据均以均数±标准差表示，三组计量资料的比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey法，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 H9C2细胞的存活率 MTT结果显示，随着多柔比星浓度的增加，对照组H9C2细胞存活率逐渐下降，呈浓度依赖性（P＜0.05）。与对照组细胞相比，5μM和10μM的秦皮乙素预处理H9C2细胞2小时，H9C2细胞的存活率明显升高（P＜0.01）；并且，10μM秦皮乙素的效果优于5μM秦皮乙素（P＜0.05）。附图A。

2.2 H9C2细胞的凋亡情况和ROS的水平 模型组H9C2细胞凋亡数量、ROS水平明显高于对照组，干预组H9C2细胞凋亡数量和ROS水平明显低于模型组（P＜0.05）。见附图B，附表：

附表 H9C2细胞ROS水平和相关蛋白的表达情况（±s ,n=3）

附表 H9C2细胞ROS水平和相关蛋白的表达情况（±s ,n=3）

与模型组比较：**P＜0.01

组别ROS水平cleaved Caspase-3cleaved PARPBidBcl-2对照组93.46±4.11**0.235±0.057**0.197±0.019**0.507±0.101**0.674±0.054**模型组189.71±7.631.492±0.1710.526±0.0610.232±0.1100.241±0.073干预组118.13±9.56**0.218±0.057**0.223±0.027**0.452±0.051**0.662±0.028**

2.3 H9C2细胞cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid和Bcl-2蛋白的表达情况 模型组H9C2细胞cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid蛋白表达明显高于对照组，Bcl-2蛋白表达明显低于对照组（P＜0.05）；干预组H9C2细胞cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid蛋白表达明显低于模型组，Bcl-2蛋白表达明显高于模型组（P＜0.05）。见附图C-D，附表。

附图 各指标检测结果

3 讨论

多柔比星（DOX）是一种广泛用于恶性肿瘤化疗的蒽环类药物，治疗肿瘤效果显著，但多柔比星具有明显的心脏毒性，严重制约了其在临床上的应用，尽可能减轻化疗时多柔比星的心脏毒性一直是临床医师关注的问题。

多柔比星诱导心脏毒性的机制比较复杂，包括细胞内活性氧生成增加、线粒体功能紊乱、DNA损伤、细胞凋亡等[7]。本研究亦证实了上述研究结果，加入多柔比星的模型组H9C2细胞凋亡数量和ROS水平明显高于对照组；同时，本研究发现，模型组H9C2细胞与凋亡相关的蛋白，cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid表达明显升高，Bcl-2表达明显降低。现已证明，细胞凋亡包括线粒体途径、死亡受体途径和内质网途径等三条。Caspase-3是凋亡过程中最关键的蛋白酶，是多种死亡受体介导的凋亡途径的共同下游效应部分。Caspase-3活化后，可酶解、切割特异性底物，如DNA依赖性蛋白激酶、固醇调控元件结合蛋白等，通过改变其结构或影响特定信号分子引起细胞凋亡[8]。cleaved PARP是凋亡细胞中活化的Caspase-3的水解产物，是细胞凋亡的标志。Bid和Bcl-2是Bcl-2家族中具有代表性的成员，Bid蛋白具有促进细胞凋亡的作用，Bcl-2可抑制细胞凋亡[9]。

本研究结果显示，加入秦皮乙素的干预组H9C2细胞，凋亡数量明显减少，ROS水平及cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid蛋白表达明显降低，Bcl-2蛋白表达明显升高。本研究提示，秦皮乙素可通过调节cleaved Caspase-3、cleaved PARP、Bid、Bcl-2等凋亡相关蛋白的表达减少细胞凋亡，以及通过减少活性氧的产生，减轻多柔比星对心肌细胞的毒性。本研究可为相关临床研究提供实验依据，但秦皮乙素减轻多柔比星致心脏毒性的其他机制尚需深入探讨。

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STUDY ON ESCULETIN REDUCE CARDIOTOXICITY INDUCED BY DOXORUBICIN

LI Xiao, XU Fan, FANG Liang, et al

(the Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To investigate the protective effects and mechanisms of esculetin (Esc) on H9C2 cells injury induced by doxorubicin (DOX).Methods:The H9C2 cells were cultured and divided into control group, model(DOX) group and intervention (Esc+DOX) group. Flow cytometry was used to detect apoptosis of H9C2 cells and reactive oxygen (ROS) level in H9C2 cells; Western blotting to detect the cleaved Caspase-3, cleaved PARP, Bid and Bcl-2 protein expression in H9C2 cells.Results:The number of apoptosis, ROS level, cleaved Caspase-3, cleaved PARP and Bid protein expression in H9C2 cells in model group were obviously higher than control group; the Bcl-2 protein expression were obviously lower (P<0.05). The number of apoptosis, ROS level, cleaved Caspase-3, cleaved PARP and Bid protein expression in H9C2 cells in intervention group were obviously lower than model group; the Bcl-2 protein expression were obviously higher (P<0.05).Conclusions:Esculetin can reduce cardiotoxicity induced by doxorubicin by reducing apoptosis and ROS level.

Doxorubicin; Esculetin; Cardiotoxicity

R453.9

A

1004-6879（2018）01-0011-04

* 河北省2017年度医学科学研究重点课题计划（20170886）

△ 通讯作者

2017-04-04）

(基础医学栏目编辑：陈志宏)