准噶尔山楂残渣多糖对D-半乳糖衰老模型小鼠的影响

马 雪，吕海英,2,*，李 进,2，张 玉，张 俊

（1.新疆特殊环境物种保护与调控生物学实验室，新疆 乌鲁木齐 830054；2.新疆师范大学生命科学学院，新疆 乌鲁木齐 830054；3.干旱区植物逆境生物学重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830054）

准噶尔山楂（Crataegus songorica K. Koch.）是蔷薇科（Rosaceae）山楂属（Crataegus）落叶灌木或小乔木植物，作为新疆特有植物，仅分布于伊犁地区[1]。其果实富含花色苷[2]、熊果酸[3]、黄酮类物质[4]等，极富营养价值，在食品、医药等方面日益受到重视。然而，准噶尔山楂果实在提取花色苷后的残渣被当成废弃物丢弃，而其中仍含有大量的多糖类物质[5]，这不仅浪费了大量的资源，而且污染了环境。研究发现多糖广泛存在于微生物细胞壁和动植物体内[6]，参与机体各种生理代谢，具有抗氧化、抗衰老、抗癌、抗肿瘤、降血糖、降血脂、免疫调节[7-15]等多种生物活性，得到广泛的应用和发展。

目前关于山楂多糖的研究主要集中在提取、纯化及结构鉴定[16-22]方面，对于提取过花色苷的山楂残渣中的多糖成分是否仍具有生物活性鲜见报道。因此，为达到高效利用新疆特有植物准噶尔山楂资源的目的，本实验以准噶尔山楂残渣为原料，通过超声波辅助水提醇沉法[23]提取多糖，研究其对D-半乳糖致衰老小鼠的影响，以期为准噶尔山楂这一特色资源的综合利用和开发提供理论依据，从而使我国西北野生植物尽快向生产转化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

准噶尔山楂成熟果实，2015年9月采于新疆伊犁果子沟。取已提取过花色苷的准噶尔山楂残渣，60 ℃烘干后磨粉，过筛，备用。

（20±2）g左右的清洁级昆明雄性小鼠90 只，由新疆维吾尔自治区实验动物中心提供，合格证号：SCXK（新）2011-0001。

总抗氧化能力（total antioxidative capability，T-AOC）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）检测试剂盒 南京建成生物工程有限公司；D-半乳糖 美国Sigma公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-2800型紫外-可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司；SHZ-III循环水多用真空泵 上海市沪西仪器厂；FA1104N电子天平、HHS-数显恒温水浴锅 上海精密科学仪器有限公司；JYD001-2007石蜡切片机 浙江金华益迪医疗设备厂；ZK-82A型真空干燥箱 上海实验仪器总厂；RE-52型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；TDL-60-B台式离心机 长沙湘仪仪器有限公司；KQ-250DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 准噶尔山楂粗多糖的制备

5 g山楂粉末→90 ℃蒸馏水浸提60 min→减压浓缩→双氧水氧化脱色→Sevag试剂除蛋白→4 000 r/min离心10 min→上清液加5 倍体积的体积分数95%乙醇溶液→4 ℃静置24 h→减压抽滤分离絮状沉淀→乙醇、丙酮溶液淋洗3 次→60 ℃恒温箱烘干→得粗多糖。

1.3.2 样品溶液的制备

取准噶尔山楂粗多糖，配制质量浓度为200、400、800 mg/mL[24]的多糖类化合物药液，于-20 ℃保存备用。

1.3.3 动物分组及给药

小鼠饲养温度（24±2）℃，相对湿度45%～65%，适应性喂养一周，根据体质量将小鼠随机分为6 组，每组15 只：正常对照组、D-半乳糖衰老模型组、多糖低剂量组、多糖中剂量组、多糖高剂量组、VE对照组。正常对照组每日上午10：00颈背部皮下注射1 mg/g mb生理盐水，其余组注射1 mg/g mbD-半乳糖药液，正常对照组、模型组给予等体积生理盐水，VE对照组灌胃50 mg/mL VE药液，多糖低、中、高剂量组分别灌胃200、400、800 mg/mL多糖类化合物药液，普通饲料常规喂养建立D-半乳糖衰老模型。小鼠每周测量2 次体质量，根据体质量变化适当增减给药剂量[25]。

1.3.4 测试样品的准备

给药8 周后，小鼠禁食不禁水12 h，称量小鼠体质量。摘除小鼠眼球，取得眼眶血，2 000 r/min离心10 min，取上层清液，-20 ℃保存备用[26]。小鼠脱臼处死后，迅速取出肝、脑组织，按1∶9（m/V）加入质量分数0.86%的生理盐水，冰水浴下研磨，使组织匀浆化，3 000 r/min离心10～15 min，取上清液-20 ℃保存备用[27]。

1.3.5 相关指标的检测

1.3.5.1 脏器指数

小鼠处死后，剖离胸腺和脾脏，称取质量，并按下式分别计算胸腺和脾脏指数。

1.3.5.2 抗氧化指标测定

取小鼠血清及肝、脑组织匀浆上清液，按照试剂盒说明书所示测定MDA含量、T-AOC及GSH-Px活力。

1.3.5.3 肝、脑组织切片的制作及病理形态学观察

小鼠解剖后迅速摘取肝、脑组织切块为1.0 cm×1.0 cm×0.2 cm的薄片→放入中性福尔马林固定液中固定24 h→分别经75%（体积分数，下同）、85%、95%、100%乙醇溶液脱水1 h→100%乙醇脱水30 min→放入二甲苯透明处理15 min→石蜡包埋组织块→切片→烤片1 d→苏木精染色液中染色10～30 min→流水冲洗约15 min→冲洗后将切片放入体积分数1%盐酸-乙醇溶液中褪色→流水中使其恢复蓝色→将切片按次序分别放入50%、70%、80%乙醇中各3～5 min→体积分数0.5%伊红复染1 min→取出后将切片放入95%乙醇中洗去多余的红色→放入无水乙醇中3～5 min→用吸水纸吸干多余的乙醇→将切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3～5 min→用中性树胶封片，并在显微镜下观察病理变化[28]。

1.4 数据处理

测定结果采用SPSS 17.0软件进行统计处理，实验数据以平均值±标准差表示。多组间差异显著性比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），各组间比较用Duncan法。

2 结果与分析

2.1 不同处理组小鼠体质量变化

表1 小鼠体质量变化趋势（n＝15）Table1 Change in body mass of mice (n= 15)g

如表1所示，在实验前5 周，各组小鼠之间体质量无显著性差异（P＞0.05），从第6周开始，除D-半乳糖衰老模型组小鼠体质量逐渐减少，其余组小鼠体质量均有所增加；第7周和第8周，除多糖低剂量组外，模型组与其他4 组小鼠体质量之间均有显著差异。颈背部皮下注射8 周后，模型组小鼠行动迟缓，整日蜷成一团，精神萎靡，毛色灰暗，形体瘦弱，呈现出明显衰老体征。说明D-半乳糖造成的衰老对小鼠体质量的改变有一定程度的影响，准噶尔山楂残渣中的多糖对衰老小鼠体质量增长缓慢有良好的改善作用。

2.2 多糖类化合物对D-半乳糖衰老模型小鼠肝组织T-AOC、GSH-Px活力和MDA含量的影响

正常机体内的自由基生成和消亡处于动态平衡中，当平衡失调，体内积累的大量自由基会使机体产生衰老症状，目前由于机体衰老引起的肝硬化已成为人类第二大健康杀手，因此肝组织的抗氧化作用已成为检测机体衰老程度的重要指标[29]。

图1 体内肝组织抗氧化实验结果Fig.1 Effect of the polysaccharides on T-AOC, GSH-Px activity and MDA content in liver

由图1可以看出，随着多糖剂量的增加，小鼠肝组织的抗氧化能力逐渐增强。与正常对照组相比，模型组的T-AOC极显著降低（P＜0.01），GSH-Px活力显著降低（P＜0.05），MDA含量极显著升高（P＜0.01），说明造模成功[30]。与模型组相比，准噶尔山楂多糖中、高剂量组的T-AOC极显著增强（P＜0.01），GSH-Px活力显著升高（P＜0.05），MDA含量显著降低（P＜0.05）。说明准噶尔山楂残渣中的多糖能有效增强小鼠的肝组织抗氧化能力。

2.3 多糖类化合物对D-半乳糖衰老模型小鼠脑组织T-AOC、GSH-Px活力和MDA含量的影响

脂质过氧化损伤以及抗氧化酶在脑组织老化中有着重要的意义，脑组织的老化会影响脑的记忆功能，并出现学习功能障碍，脑损伤进一步发展成为阿尔茨海默病，所以脑组织中的抗氧化酶活力是机体衰老程度的又一重要指标[31]。

图2 体内脑组织抗氧化实验结果Fig.2 Effect of the polysaccharides on T-AOC, GSH-Px activity and MDA content in brain

由图2可以看出，与正常对照组相比，模型组T-AOC有所降低，但差异不显著（P＞0.05），MDA含量显著升高（P＜0.05），GSH-Px活力极显著降低（P＜0.01）。与模型组相比，多糖高剂量组小鼠脑组织T-AOC和MDA含量均极显著变化（P＜0.01）。说明准噶尔山楂残渣中的多糖可有效提高D-半乳糖致衰老小鼠脑组织中T-AOC、GSH-Px活力，同时能够降低脑组织中的MDA含量，以清除体内的自由基等氧化性物质，对于D-半乳糖造成的小鼠衰老现象具有一定的延缓作用。

2.4 多糖类化合物对D-半乳糖衰老模型小鼠血清T-AOC、GSH-Px活力和MDA含量的影响

由图3可以看出，不同剂量的多糖对D-半乳糖造成的小鼠衰老情况具有不同程度的改善作用。与正常对照组相比，模型组血清中T-AOC显著降低（P＜0.05），GSH-Px水平极显著降低（P＜0.01），MDA含量显著升高（P＜0.05）。与模型组相比，多糖中、高剂量组T-AOC和GSH-Px活力均显著增加（P＜0.05）；多糖高剂量组MDA含量极显著降低（P＜0.01）。说明准噶尔山楂多糖类物质的添加可以改善由于D-半乳糖造成的衰老小鼠血清中T-AOC、GSH-Px活力降低，并一定程度上抑制血清中MDA含量的升高，进一步起到抗机体氧化的作用。

图3 体内血清抗氧化实验结果Fig.3 Effect of the polysaccharides on T-AOC, GSH-Px activity and MDA content in serum

2.5 多糖类化合物对D-半乳糖衰老模型小鼠胸腺和脾脏指数的影响

脾脏和胸腺是体内重要的免疫器官，当机体衰老时，免疫器官萎缩从而导致免疫功能降低。脾脏是机体最大的周围淋巴器官，不仅是机体质量要的免疫应答场所，同时还担任着机体重要的造血功能。胸腺质量及指数是胸腺在机体内大体形态的重要指标，因此胸腺和脾脏的衰老和萎缩间接反映了机体免疫系统的情况[32]。

从图4可以看出，与正常组相比，模型组胸腺和脾脏指数变化不显著（P＞0.05）；与模型组相比，不同剂量多糖组和VE对照组的小鼠胸腺指数和脾脏指数均有不同程度的增加，但差异均不显著（P＞0.05）。说明准噶尔山楂多糖不会对动物的内脏造成损伤。

图4 多糖对衰老小鼠胸腺和脾脏指数的影响Fig.4 Effect of the polysaccharides on thymus and spleen indexes of aging mice

2.6 肝脏病理学切片观察

图5 多糖对衰老小鼠肝组织的影响（×200）Fig.5 Effect of the polysaccharides on liver tissues in aging mice observed by HE staining (× 200)

由图5可知，正常对照组（图5A）肝小叶及肝细胞结构正常，肝索排列整齐，肝窦正常。模型组（图5B）肝细胞及胞核体积缩小，染色程度增强，肝细胞之间连接松散，部分可见轻度脂肪变性。VE对照组（图5C）肝细胞及胞核体积较衰老组增大，少量肝细胞胞浆内可见脂滴颗粒，肝索较宽，部分肝细胞可见双核。多糖低（图5D）、中剂量组（图5E）肝细胞及胞核体积增大，部分肝细胞可见脂肪变性，尤以肝小叶周边为重。多糖高剂量组（图5F）肝细胞及细胞核结构、大小及其染色程度未见明显异常，个别肝细胞胞浆内可见脂滴颗粒，肝索结构无明显异常。说明准噶尔山楂残渣中的多糖对D-半乳糖引起的衰老小鼠肝损伤有一定抑制作用。

2.7 海马切片病理学观察

图6 多糖对衰老小鼠脑组织的影响（×400）Fig.6 Effect of the polysaccharides on brain tissues in aging mice observed by HE staining (× 400)

由图6可知，正常对照组（图6A）海马神经元数量较多，神经元细胞形态结构清晰完整，大小均匀且列紧密整齐，细胞胞浆丰富，核仁清晰。模型组（图6B）神经元数量减少，排列松散紊乱，边界不清，胞浆少，细胞核固缩，少数神经细胞变性坏死，部分锥体细胞形态异常。VE对照组（图6C）神经元数目形态正常，排列较为紧密，细胞结构清晰，变性坏死较少。多糖低剂量组（图6D）神经元数量较少，排列疏松紊乱，细胞形态不规则，有少量细胞核固缩。多糖中剂量组（图6E）神经元数量较低剂量组多，排列基本正常，边界不清。多糖高剂量组（图6F）神经元数量较多，排列紧密，边界清晰，细胞核固缩少见。说明准噶尔山楂残渣中的多糖对D-半乳糖致衰老小鼠海马区神经元损伤有一定抑制作用。

3 结 论

通过对准噶尔山楂残渣中的多糖进行粗提取后，给D-半乳糖衰老小鼠灌胃多糖物质，分析其对小鼠体内抗氧化酶活力和肝组织、海马区神经元的影响。结果表明准噶尔山楂残渣中的多糖可以使D-半乳糖衰老模型组小鼠的肝、脑组织和血清中GSH-Px活力、T-AOC上升，抑制MDA含量上升，并使模型组小鼠体质量上升。从细胞形态上看，与模型组相比，多糖中、高剂量组肝细胞和海马区神经元细胞形态明显好转，神经元数量增加，细胞间隙变小，细胞核固缩情况减少，排列较模型组整齐，说明提取过花色苷后的准噶尔山楂残渣中的多糖成分对D-半乳糖引起的小鼠衰老具有良好的延缓作用，对于预防氧化损伤具有明显的促进作用，其综合利用和开发值得重视。